细胞外基质对哮喘大鼠气道平滑肌细胞PI3Kp85表达的影响

　　【摘要】 目的:研究细胞外基质(ECM)对哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs)磷脂酰肌醇-3-激酶p85(PI3Kp85)表达的影响。方法:卵白蛋白(OVA)致敏法复制大鼠哮喘模型，将培养后的大鼠叶支气管ASMCs分别种植在涂覆有纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原及层粘蛋白的培养瓶中培养，Western blot检测各组ASMCs中PI3Kp85蛋白表达，Real-time PCR检测其mRNA。另取12只正常大鼠做对照。结果:哮喘纤维连接蛋白组、层粘蛋白组、Ⅰ型胶原蛋白组ASMCs中PI3Kp85 mRNA的表达分别是(7.63±0.61)、 (9.73±0.68)、(16.22±0.88)，均明显高于对照组(5.93±0.75)(P<0.01);蛋白表达情况与mRNA趋势一致。结论:纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原及层粘蛋白可以上调哮喘大鼠气道平滑肌细胞中PI3Kp85表达。

　　【关键词】 哮喘;气道平滑肌细胞;细胞外基质;磷脂酰肌醇-3-激酶

　　Influence of Extracellular Matrix Protein on Phosphatidylinositol 3-Kinase p85 of Airway Smooth Muscle Cells in Rats with Asthmatic WANG Zheng-yan,LI Rui,WANG Cheng-guo* ,LIU Jin,XU Shu-yun,XUE Ke-yingepartment of Respiratory Medicine,Dongfeng Hospital，Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000;Department of Respiratory Medicine,Tongji Hospital,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan,Hubei 430030;Department of Osteology,Renmin Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)Abstract:Objective To investigate the influence of extracellular matrix(ECM) protein on the expression of phosphatidylinositol 3-kinase p85(PI3Kp85) of airway smooth muscle cells(ASMCs) in asthmatic rats.Methods The rats model of asthma were induced with OVA injection,the cultured ASMCs of rats lobe bronchus were implanted into flasks treated with fibronectin,collagen-Ⅰ and laminin.The expression of PI3Kp85 protein was determined with Western blotting,and the mRNA expression of PI3Kp85 was detected by real-time PCR.Another 12 rats were selected as healthy controls.Results The expression of PI3Kp85 mRNA in asthmatic group treated with fibronectin,collagen-Ⅰ and laminin were 7.63±0.61,9.93±0.12,16.22±0.88,respectively.They were all significantly higer than that of control group(5.93±0.75)(P<0.01).The expression of PI3Kp85 protein was similar to PI3Kp85 mRNA.Conclusion Fibronectin,collagen-Ⅰ and laminin could up-regulate the expression of PI3Kp85 in ASMCs of asthmatic rats.

　　Key words:Asthma;Airway smooth muscle cells;Extracellular matrix;Phosphatidylinositol 3-kinase

　　气道平滑肌细胞(Airway smooth muscle cells，ASMCs)及细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)作为维持气道壁结构和功能的组成部分，在哮喘气道炎症和气道重塑中起着重要作用[1-2]。哮喘病理进程不仅有ASMCs数量增加和功能改变，而且ECM也存在改变，二者相互作用。ECM能调控ASMCs的增殖和迁移[3]，但调控的分子机制尚不清楚。研究表明[4]磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol 3-Kinase,PI3K)信号通路是调控哮喘ASMCs增殖的主要途径，但其是否参与ECM对哮喘ASMCs的功能调控的研究并不多见。本实验将通过大鼠气道平滑肌细胞ASMCs种植于细胞外基质，检测其中PI3Kp85蛋白及mRNA的表达，以探索ECM是否通过PI3K信号途径对哮喘ASMCs的功能进行调控。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　24只健康雄性Wistar大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物中心)。卵白蛋白(Ovalbuin,OVA)、大鼠纤维连接蛋白、层粘蛋白、Ⅰ型胶原(美国sigma公司);胎牛血清(Fetus bovine serum,FBS)、木瓜蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、总RNA提取试剂(Trizol，美国Gibco公司);小鼠抗肌动蛋白(α-actin)抗体(北京中山生物公司);引物购自美国INVITROGEN公司上海合成分部。SYBR GreenⅠ荧光染料(美国Biotium公司);兔抗PI3Kp85多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)。

　　1.2 大鼠ASMCs的培养、鉴定及分组

　　24只大鼠(体重150~200 g)按体重编号,采用随机排列表法分为哮喘组和对照组,每组大鼠各12只。参照文献[5]建立哮喘大鼠模型，对照组用0.9%生理盐水代替OVA。模型成功后用20%乌拉坦麻醉,分离叶支气管，将支气管平滑肌组织剪成1 mm×1 mm×1 mm的组织块，置D-Hanks液(1 mg/mLⅠ型胶原酶、1 mg/mL木瓜蛋白酶、10 mg/mL BSA)37 ℃消化约15 min后，980 r/min离心10 min，弃上清,DMEM洗涤2次;DMEM悬浮分离细胞种植于25 mL培养瓶内,置37 ℃、5%CO2培养箱培养,每2~3天换液一次,5~7 d 80%融合后传代培养,α-actin DAB染色鉴定，取2~5代细胞用于实验。

　　参照文献[6]，将ASMCs分别种植在含ECM(纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原、层粘蛋白各为10 μg/mL)的培养瓶中培养。哮喘组分为纤维连接蛋白组(A1)，层粘蛋白组(A2)，Ⅰ型胶原组(A3)，空白组(A4)。对照组分为纤维连接蛋白组(B1)，层粘蛋白组(B2)，Ⅰ型胶原组(B3)，空白组(B4)。

　　1.3 Western Blot检测ASMCs中PI3Kp85蛋白表达

　　细胞提取蛋白后,测定蛋白质含量。取100 μg蛋白加入上样缓冲液,12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后湿转至硝酸纤维素膜上,室温封闭2 h,加一抗(兔抗大鼠PI3Kp85 1∶300)4 ℃孵育过夜;加入1∶2 500稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G二抗,室温孵育2 h，洗膜后化学发光试剂显影。用GDS 8000型成像分析系统(英国UVP)测量蛋白条带的灰度值。

　　1.4 实时荧光定量PCR检测ASMCs中PI3Kp85 mRNA的表达

　　各组ASMCs培养48 h后，Trizol法提取mRNA,逆转录成cDNA,应用SYBR GreenⅠ荧光技术行实时定量PCR，管 家 基 因GAPDH作内参。GAPDH上游引物:5′-CACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3′,下游引物:5'-GACGCCAGTAGACTCCACGAC-3′,退火温度58 ℃;PI3Kp85上游引物:5′-CAAAGCCGAGAACCTATTGCGAG-3′;下游引物:5'-GTTTGACTTCGCCATCTACCAC-3′,退火温度57 ℃。PCR反应条件：预变性94 ℃ 3 min，变性94 ℃ 30 s,退火55 ℃ 30 s,2 ℃ 30 s延伸,共进行45轮循环，最后延伸72 ℃ 10 min。

　　Real-time PCR结果通过计算机软件分析得出,得到每个样本PCR反应的循环域值(cycle threshold,CT),即模板cDNA经PCR扩增达到某一荧光强度的循环次数。本实验使用的是相对定量Real time PCR方法,将目的基因PI3Kp85同管家基因GAPDH的比值,即对照组大鼠ASMCs空白组(B4组)中各目的基因表达作为参照因子，通过2-△△CT方法计算各干预组中目的基因相对参照组目的基因的表达。△△CT=(CT目的基因-CTGAPDH)实验组-(CT目的基因-CTGAPDH)参照组。

　　1.5 统计学处理

　　所有数据用均数±标准差(x±s)表示，多组间均数比较采用方差分析F检验，组间两两比较采用q检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 ASMCs细胞鉴定

　　ASMCs细胞为梭形，见图1,呈现“峰和谷”生长状态;α-actin免疫细胞化学染色阳性,鉴定培养的细胞为平滑肌细胞，见图2。

　　2.2 ASMCs中PI3Kp85蛋白的表达

　　图3 Western Blot检测PI3Kp85蛋白表达

　　A1:哮喘纤维连接蛋白组;A2:哮喘层粘蛋白组;A3:哮喘Ⅰ型胶原组;A4:哮喘空白组。

　　B1:对照纤维连接蛋白组;B2:对照层粘蛋白组;B3:对照Ⅰ型胶原组;B4:对照空白组。

　　图3、表1可见，哮喘纤维粘连蛋白组、层粘蛋白组、Ⅰ型胶原组PI3Kp85蛋白的表达显著升高(P<0.01)，均明显高于对照组(P<0.01);对照组各组间无显著性差异(P>0.05)。

　　2.3 ASMCs中PI3Kp85 mRNA的表达

　　表1显示哮喘组ASMCs(A组)分别用纤维连接蛋白、层粘蛋白、Ⅰ型胶原干预后， PI3Kp85 mRNA的表达水平明显高于哮喘空白组(A4组)(P<0.01);对照组变化均不明显(P>0.05)。

　　表1 PI3Kp85 mRNA及蛋白的含量比较(略)

　　注：与A4比较,*P<0.01;与B4比较,△P<0.01;与B4比较,#P>0.05

　　3 讨论

　　ASMCs及ECM作为气道壁维持气道结构和功能的重要组成部分，二者的相互作用在哮喘气道炎症和气道重塑中起着重要作用。ECM能调控ASMCs的生存、增殖和迁移等生物学行为，但其分子机制尚不清楚。PI3K是调控哮喘ASMCs增殖等生物学行为的重要信号分子，而且在众多环节上参与哮喘的发病过程[2,4]，但是否参与ECM对哮喘ASMCs的功能调控，国内外亦无报导。

　　本研究用不同类型的细胞外基质(纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原、层粘蛋白)联合哮喘大鼠ASMCs共培养，检测了PI3Kp85的表达情况。结果表明，无论是在基因水平还是蛋白表达水平上， 哮喘组PI3Kp85表达均明显高于空白组，表明ECM(纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原、层粘蛋白)可上调哮喘ASMCs中PI3Kp85表达。国外有研究[6-8]表明，ECM与整合素结合后可激发细胞内多种信号反应：如激活丝氨酸/苏氨酸激酶家族如丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、蛋白激酶C(PKC)、多种磷脂酶和脂类激酶如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)等，这些信号反应又可进一步序贯激发细胞内一系列重要的信号转导网络，从而调控炎症及免疫应答，影响细胞生长、增殖及免疫等多种生理功能和病理变化。故推测ECM可能也是与整合素结合后激发细胞内PI3K信号通路，从而对哮喘ASMCs的功能进行调控。

　　PI3K家族在细胞信号转导中最为重要的是Ⅰ型PI3K。最近研究[4]认为，PI3K通过产生脂类第二信使分子,导致众多细胞内信号级联通路的活化,它在哮喘ASMCs生长、增殖、生存及迁移中起着十分关键的作用。Scott[4]等首先证实PI3K的活性与培养的牛气道平滑肌的有丝分裂成正比,应用PI3K抑制剂Wortmannin可显著减少(达90%以上)牛气道平滑肌细胞DNA合成。PI3K作为磷酸化膜上磷脂酰肌醇D3肌醇环的酶家族,并且作为蛋白激酶磷酸化靶蛋白的丝氨酸基团;D3磷脂酰肌醇作为第二信使并激活下游的效应分子,如P70S6 K、 蛋白激酶B(PKB)和Akt。PI3K/AKT通路是PI3K主要介导的下游信号传递途径,其中蛋白激酶B(PKB)在PI3K信号转导途径中起着关键作用，它是逆转录病毒Aktδ的癌基因产物,故又称Akt。当细胞在受到激素、 生长因子和细胞因子刺激后,无活性的胞质PKB得到PI3K的产物 PI (3,4)P2,PI (3,4,5) P3,它们与PKB的PH区特异性结合,诱使其构象发生变化,并转位至胞质膜,发生磷酸化而激活。PKB激活后可以抑制多种刺激诱发的细胞凋亡,促进细胞周期的进展，介导细胞生长与增殖、蛋白质合成、抗凋亡等细胞事件。

　　哮喘气道ECM类型不同，对PI3Kp85表达以及对哮喘ASMCs功能的影响也可能不同。国外有报道[9-11]，在哮喘气道ECM各组分中，纤维连接蛋白、Ⅰ型、Ⅲ型及Ⅴ型胶原和层粘蛋白等明显增加，而Ⅳ型胶原、弹力蛋白等则减少，其增加/减少的幅度和哮喘的严重程度密切相关;增加的ECM沉积在哮喘整个气道壁，以平滑肌层及上皮下最为明显，不仅参与气道慢性炎症和气道重塑，也可能对ASMCs的各种生物学行为产生重要的调控作用。

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