靶向X基因shRNA特异抑制HBV基因表达和复制

　　【摘要】 目的：研究针对HBV X基因小发夹RNA(shRNA)对HBV基因表达和复制的抑制作用。方法：利用分子克隆方法构建了4个HBV X基因特异性shRNA的表达质粒pshHBx14，与HBV复制性质粒共转染HepG2细胞，Northern和Southern印迹法检测HBV的mRNA和病毒复制中间体，化学发光微粒免疫分析方法检测细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg,免疫荧光染色分析细胞HBcAg的表达水平。结果：共转染pshHBx14显著抑制HBV mRNA表达、降低细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的水平和细胞内HBcAg的表达水平、并有效抑制HBV的病毒复制中间体的合成。结论：HBV X基因特异性的shRNA可以有效抑制HBV的基因表达和病毒复制，有可能发展成为新的抗HBV制剂。

　　【关键词】 RNA干扰;小干扰性RNA;发夹状RNA;乙型肝炎病毒;基因治疗

　　The Specific Inhibitory Effect of shRNA Targeting X Gene on Hepatitis B Virus Gene Expression and Replication MENG Zhongji1，KE Changzheng1，TANG Shoubing1,CHEN Yue1,LU Mengji2,YANG Dongliang3 (1Department of Infectious Diseases,Taihe Hospital,Yunyang Medical Collage,Shiyan,Hubei 442000,China;2Institute of Virology,University Hospital of Essen,University DuisburgEssen,Essen,Germany;3Division of Clinical Immunology,Tongji Hospital of Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan,Hubei 430030,China)

　　Abstract：Objective To investigate the inhibitory effect on Hepatitis B virus (HBV) gene expression and replication by small hairpin RNAs (shRNA) targeting X gene.Methods Four eukaryotic expression plasmids (pshHBx14) were constructed to express shRNAs targeting HBV X gene with molecular cloning methods.HepG2 cells were cotransfected with the shRNA expression plasmids and a replicationcompetent HBV construct.The mRNA of HBV and replicative intermediates were determined with Northern blot and Southern blot, the expression of HBcAg was analyzed with immunofluorescence staining.Results Cotransfection of pshHBx14 was significantly inhibited the expression of HBV mRNA,decreased the expression levels of HBsAg and HBeAg in cell culture supernatant and intracellular HBcAg,effectively inhibited the synthesis of HBV replicative intermediates.Conclusion Xgene specific shRNAs can effectively inhibit HBV gene expression and replication and may develop a novel antiviral agent for HBV infection treatment.

　　Key words:RNA interference,RNAi;Small interfering RNA,siRNA;Short hairpin RNA,shRNA;Hepatitis B virus,HBV;Gene therapy

　　嗜肝DNA病毒是一类已知的最小的DNA病毒，具有嗜肝特性和严格的种属特异性，容易发生持续感染，并具有高度致癌潜能。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)是嗜肝DNA病毒科的成员之一，尽管乙肝疫苗可以有效预防HBV感染，HBV感染仍然是人类一大健康问题，严重威胁人类的健康。目前全球大约有3.5亿HBV慢性感染患者，其中15%～25%的患者有罹患晚期肝硬化和肝细胞癌的风险[1]。目前应用于慢性乙肝的治疗药物主要是干扰素和核苷类似物。在干扰素的治疗中，仅1/3的患者可获得持续应答。核苷类似物虽然可以有效抑制HBV的复制，但长期应用会产生HBV耐药性突变株[2]，故亟需开发新的抗HBV药物。

　　RNA干扰(RNA interference，RNAi)是普遍存在于生物体中的一种序列特异性的基因表达调控方式，它是由小的干扰性RNA(small interfering RNA,siRNA)介导的序列特异性降解mRNA的过程[3]。研究表明，向哺乳动物细胞内导入21～23 nt的siRNA或导入能够转录这种siRNA的载体，可以特异性抑制诱导靶mRNA的产生，从而控制胞内病原体的复制过程。siRNA可以抑制许多临床疾病相关的病毒，如人类免疫缺陷病毒，丙型肝炎病毒和HBV等[4-6]。在针对HBV的RNAi研究中，不同的研究者使用不同的靶序列，HBV的抑制效果报道不一[7-13]。本研究设计针对HBV X基因的小发卡RNA(small hairpin RNA,shRNA)，研究其对HBV基因表达和复制的抑制作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　HBV复制性克隆pHy106+wta质粒(杜伊斯堡-艾森大学医学院病毒学研究所提供)包含1.3×HBV基因组DNA(D基因型,ayw亚型，GenBank accession no.V01460)[14]。shRNA表达质粒psiRNAvector(由美国Baylor医学院冯新华教授提供)含有哺乳动物H1启动子，在转染哺乳动物细胞后可转录出shRNA。psiWx1可表达针对土拨鼠肝炎病毒X mRNA的shRNA[15]。100 bp plus DNA ladder购自Plasmid Factory。限制性内切酶EcoR I、Sal I， T4DNA连接酶等购自New England Biolabs。HepG2细胞为本实验室保存。LipofectineTM 为Invitrogen公司产品。探针标记试剂盒PrimeαGene Labeling System 购自美国Promega公司。GeneScreenPlus尼龙膜为NEN公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 shRNA表达质粒的构建:使用Ambion公司在线设计软件结合Reynolds[16]等提出的设计方案设计针对HBV X基因nt1656-nt1666 (shHBx1),nt1679nt1699 (shHBx2),nt1755nt1775 (shHBx3)和nt1775nt1795 (shHBx4)位点的siRNA。合成序列两端分别带有BamH I和Sal I位点。合成的单链DNA模板先经5′磷酸化、变性、退火，然后克隆到psiRNA的Bgl II、Sal I位点，酶切鉴定并测序。

　　1.2.2 HepG2细胞的培养及转染:HepG2细胞用含10%新生牛血清(FCS)、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的高糖DMEM培养液，于37 ℃、5%CO2 培养箱中培养。细胞转染参照LipofectineTM说明书进行。

　　1.2.3 细胞总RNA的提取和Northern杂交:细胞总RNA的提取采用TRIzol试剂，按说明书操作。5 μg的总RNA以1.2%的乙二醛变性琼脂糖凝胶分离，然后于转移缓冲液中(0.01 mmol/L NaOH3 mmol/L NaCl)转印到GeneScreenPlus尼龙膜上，与32P标记的HBV全长探针杂交。杂交信号在PhosphoImager (Cyclon,Parkard,Meriden,CT,USA)上检测分析。

　　1.2.4 核衣壳相关HBV复制中间体的提取和Southern杂交:核衣壳相关HBV复制中间体的提取参考文献[14]。核衣壳相关HBV复制中间体以1.0%的琼脂糖凝胶分离，然后于转移缓冲液(0.5 mmol/L NaOH1.5 mmol/L NaCl)中转印到GeneScreenPlus尼龙膜上，与32P标记的HBV全长探针杂交。杂交信号在PhosphoImager (Cyclon)上检测分析。

　　1.2.5 HBsAg和HBeAg检测:细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg采用Abbott公司的化学发光微粒免疫分析(chemiluminescent microparticle immunoassay,CMIA)试剂盒检测。参照产品说明书进行。

　　2 结果

　　2.1 HBV X基因特异性shRNA表达质粒的构建与鉴定

　　采用Ambion公司的 siRNA在线设计软件对HBV X基因进行分析，初步筛选潜在的siRNA靶序列。然后根据Reynolds等人发表的siRNA靶点设计评价标准，对候选的靶位点进行逐一评价，最后选取累计分值最高的4个靶序列(图1A)。合成相应的shRNA DNA模板序列，克隆到psiRNA载体上(图1B)，EcoR I和Sal I酶切获得300 bp片段，证明shRNA DNA模板序列成功插入到psiRNA载体(空载体EcoR I和Sal I酶切产物大小为250 bp)(图2)。DNA测序结果证实四个shRNA表达质粒中插入序列与设计序列完全一致(结果未显示)。

　　2.2 shRNA抑制HBV抗原表达和复制呈剂量依赖性

　　将不同浓度的pshHBx1和0.5 μg的pHy106+wta共转染HepG2细胞，转染后的第72 h收集细胞和培养上清，CMIA检测HBsAg和HBeAg的表达水平，Southern blotting检测HBV复制水平。实验结果显示，共转染pshHBx1后HepG2细胞内HBV复制水平和培养上清中HBsAg和HBeAg的表达水平均显著降低，呈现剂量依赖性。低剂量(25 ng)的pshHBx1即可抑制50%以上的HBsAg，当剂量增加到100 ng后，HBsAg的抑制作用达到平台，再增加剂量至500 ng时，90%以上的HBsAg被抑制(图3A)。然而低剂量(25 ng)的pshHBx1对HBV复制的抑制作用不明显，当剂量增加到100 ng时，50%左右的病毒复制中间体被抑制，500 ng时抑制效率为80%(图3B)。

　　2.3 靶向X基因shRNA特异抑制HBV的基因表达和复制

　　为确定四种shRNA对HBV基因表达和复制的抑制作用，pshHBx14(0.5 μg)分别与pHY106+twa(0.5 μg)共转染HepG2细胞，72 h后检测细胞内HBV mRNA,DNA复制中间体，细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg。结果显示，与未处理组比较，pshHBx14共转染都可以显著降解HBV mRNA (抑制率分别为：85%，68%，81%，70%)(图4A)，抑制HBsAg和HBeAg的表达(抑制率分别为：93.26%/69.78,85.91%/59.43%,93.49%/71.10%,80.71%/58.68%)(图4C)，抑制HBV复制(抑制率分别为：83%，57%，83%，68%) (图4B)。间接免疫荧光染色结果显示共转染pshHBx1可以显著减少HBcAg的表达。而共转染WHV特异性shRNA表达质粒对HBV的基因表达和复制没有明显的抑制作用(图4D)。

　　3 讨论

　　本研究成功构建靶向HBV X基因的shRNA表达质粒pshHBx14，试验中使用的psiRNAvector质粒上携带有哺乳动物H1启动子，可以在预先设计的位点精确启动转录，表达出具有茎-环结构的shRNA。早期的试验已证明这种shRNA表达质粒可以高效稳定表达shRNA,抑制靶基因的表达[17]。本研究中shRNA表达质粒pshHBx与HBV复制性质粒共转染HepG2细胞后，有效抑制HBV的mRNA转录、HBsAg和HBeAg的合成分泌、以及HBcAg的表达，同时抑制病毒的复制水平。其中以shHBx1和shHBx3的抑制效率最高。

　　HBV有4种转录物：3.5 kb mRNA既是负链DNA的合成模板(亦称前基因组RNA,pgRNA)，又是核心蛋白和病毒多聚酶的合成模板;2.4 kb mRNA负责PreS1蛋白的合成;2.1 kb mRNA负责合成PreS2和HBsAg;0.7 kb mRNA负责X蛋白的合成[1]。由于X区核苷酸序列为所有4种HBV mRNA所共有(图1)，靶向X基因的siRNA可以降解这四种mRNA，从而抑制HBV复制和包装必需的各种蛋白质(PreS1,PreS2,HBsAg,HBcAg,DNA多聚酶)的合成，以及子代病毒负链DNA的合成，因而可以有效抑制病毒的复制。

　　本研究结果显示3.5 kb、2.4 kb/2.1 kb mRNA受到shRNA一致性的抑制，HBsAg、HBeAg、HBcAg的表达均被干扰，病毒复制过程被阻断，从而显著减少病毒复制中间体的产生。由于0.7 kb mRNA的丰度较低，不易在Northern杂交实验中检测出。X蛋白的检测也因为缺乏相应的抗体而不作为常规检测指标。但是根据Northern结果中其它3种mRNA的水平变化可以推断0.7 kb mRNA肯定也一致性的被shRNA降解。

　　HBV X基因是HBV病毒基因组中最小的开放性读码框,位于HBV基因组的1 374～1 838 bp处,全长435～462 bp,编码长度为154个氨基酸的X蛋白(PX)。PX是一种多功能蛋白,通过反式激活作用参与调节病毒复制;与宿主细胞内的转录因子直接结合,或通过信号转导途径激活细胞转录因子,对宿主细胞基因转录进行调控,激活细胞癌基因,或抑制抑癌基因的表达和功能,促使细胞表达各种与侵袭性有关的基因,增加细胞侵袭能力,或上调抗化疗药物的基因表达,使细胞对化疗药物耐受; 打乱正常细胞周期,干扰DNA受损细胞的修复,造成遗传物质的不稳定性;打破正常的细胞凋亡与增殖的平衡,一方面促进细胞DNA合成,增殖能力增强,另一方面促进细胞凋亡,刺激再生反应,有利于病毒颗粒自凋亡细胞中释放并继续干扰其他细胞,促进炎症发展，凋亡效应还可增加突变机率,使肝细胞生长失去抑制,最终导致HCC的发生;与线粒体外膜蛋白作用, 增加外膜通透性, 降低跨膜电压干扰线粒体氧化磷酸化等能量代谢过程,造成细胞氧化损伤,促进细胞凋亡。

　　在HBV感染和HCC发展的不同阶段, PX执行不同的生物学功能[18]。阻断PX的细胞毒性作用对于防止病毒感染播散、减缓肝细胞的恶变和肿瘤的发生尤为重要。RNAi技术为HBV感染的治疗提供了崭新的策略。由于RNAi特异地作用于靶基因，而且没有明显毒副作用，其应用于HBV感染的治疗具有明显的优势。HBx作为HBV基因治疗理想的靶基因,HBx特异性shRNA可以降低病毒的RNA和蛋白水平,阻止或降低病毒复制,或通过阻止、缓解HBx对细胞的毒性作用,达到治疗目的。

　　本研究在体外成功筛选出两个高效的HBV X基因特异性的shRNA，下一步将在HBV急性感染的高压水注射模型和HBV转基因小鼠模型中进一步研究这种shRNA的体内抗病毒活性和安全性。为实现RNAi介导的基因治疗提供理论和技术支持。

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