L_型钙通道激动剂对心肌细胞局部诱发钙释放的影响

　　【摘要】 目的：研究L_型钙通道激动剂(FPL64176)对心肌细胞局部诱发钙信号的影响特点。方法：采用非紧密封接膜片钳技术与激光扫描共聚焦显微镜钙成像技术相结合的方法，局部触发细胞内钙释放。此技术可自由控制膜去极化水平，使FPL64176只在局部发挥作用。结果：正常情况下，局部兴奋_收缩耦联概率(δSC)和平均诱发钙瞬变与膜去极化水平的关系均呈“钟形”电压_依赖特性。FPL64176作用下，δSC和局部平均诱发钙瞬变均有不同程度的增强(P<0.05);低膜电位水平下的孤立钙火花幅度也明显增大(P<0.05)。结论：“钟形”电压_依赖特性说明，本质上此兴奋_收缩耦联的机制是钙诱导钙释放，而不是由于去极化本身所致。FPL64176不影响局部细胞内钙释放的“钟形”电压_依赖特性。

　　【关键词】 FPL64176;膜片钳;局部钙释放;心肌细胞

　　Effects of L_type Calcium Channel Activator on Local Evoked Calcium Release

　　in Myocardial CellsSHEN Jian_xin1，WANG Hai_yan2

　　(1 Department of Physiology，Shantou University Medical College，Shantou 515041，China，2 Department of Pathophysiology，Shantou University Medical College，Shantou 515041，China)

　　[Abstract]Objective： To investigate the effects of L_type calcium channel activator(FPL64176)on local evoked calcium release in myocardial cells. Methods： Using loose_seal patch clamp technique combined with laser scanning confocal microscopic calcium imaging，the intracellular calcium release was triggered locally. The membrane potential could be controlled optionally and FPL64176 could only take effect locally. Results：Under the control condition， the local excitation_contraction coupling fidelity(δSC)and averaged local evoked calcium transients were bell_shaped voltage_dependent on the membrane potentials. With FPL64176 within the pipette，　δSC and averaged local evoked calcium transients were all enhanced differentially(P<0.05). At low membrane potential，the amplitude of solitary calcium sparks increased with FPL64176(P<0.05). Conclusion：The bell_shaped voltage_dependence shows that the local excitation_contraction is also through the mechanism of calcium_induced calcium release，but not through the membrane depolarization itself. And FPL64176 does not change this voltage_dependence.

　　[Key Words]FPL64176，patch clamp，local calcium release，myocardial cell

　　心肌细胞膜上存在电压_依赖性L_型钙通道(LCCs)。正常情况下，心肌细胞兴奋产生的动作电位可通过横管系统到达心肌细胞深处，使其膜上的LCCs因膜去极化而开放，细胞外少量钙离子内流，在全细胞范围内作用于邻近相应的雷洛丁受体从而引发细胞内钙库在短时间内释放大量的钙，产生钙瞬变[1_2]。如用Loose_patch法[3～5]则可使局部心肌细胞膜去极化，从而只有少量LCCs开放，少量内流的钙可诱发局部胞内钙库释放钙，产生局部诱发钙信号。钙火花就是这样一种钙信号。一般情况下，因为通过LCCs内流的钙太少，因此诱发局部细胞内钙信号的成功率并不高。L_型钙通道激动剂(FPL64176)可延长钙通道的开放时间，使内流的钙增多，有效地诱发了局部细胞内钙信号，有利于研究钙释放事件的特征和规律[4， 6]。本课题研究FPL64176对心肌细胞局部诱发钙信号的影响特点。

　　1 材料与方法

　　1.1 急性心室肌单细胞分离

　　心室肌单细胞取自成年SD大鼠(北京大学动物中心提供。2～3月龄，体质量200～300g)。采用通用标准酶解分离技术分离细胞[3， 7]：按100mg/kg腹腔注射5_乙基_5_(1_甲基丁基)_2，4，6(1H，3H，5H)_噻啶三酮_钠盐(戊巴比妥钠)麻醉大鼠，打开胸腔，取出心脏，用胶原酶(Worthington type Ⅱ，1mg/mL)经主动脉逆向灌流心脏，切碎心肌并经适当震荡即可获得分散的单个心肌细胞。分离过程中使用HEPES缓冲液(137mmol/L　NaCl，5.4mmol/L　KCl，1.2mmol/L　MgCl2，1.2mmol/L　NaH2PO4，1mmol/L　CaCl2，10mmol/L葡萄糖和20mmol/L　HEPES;pH用NaOH调至7.4)。

　　1.2 荧光染料加载

　　分离的单个心肌细胞先与钙荧光指示剂(fluo4_AM，终浓度15μmol/L)(Molecular Probes公司，美国)共同孵育5min，之后以正常细胞外液灌流10min，以除去细胞外多余的荧光染料并使进入细胞内的fluo4_AM所携带的AM基团(一酯类基团，fluo4带上它后即可自由过膜)被细胞内相应的酶除去。加载好荧光染料的细胞置于LSM_510倒置共聚焦显微镜系统(Zeiss公司，德国)的载物台上。

　　1.3 选择合适细胞

　　实验用细胞需符合以下标准：①横纹清晰;②呈杆状;③表面干净平整;④观察1min未发现有自发收缩活动。

　　1.4 形成非紧密封接的膜片钳细胞贴附实验模式

　　非紧密封接的膜片钳技术[7]与膜片钳技术中的细胞贴附膜片钳制方式相似。但最终形成的封接电阻(20～40MΩ)较低(一般膜片钳实验要求形成的封接电阻为GΩ以上)。实验过程既要避免形成高阻抗封接(以免变形影响局部兴奋_收缩耦联关系)，又要保证能稳定钳制局部斑片膜的电压。此实验模式的目的在于定点诱发膜的局部去极化，从而激发局部钙释放，且可通过改变钳制电压自由控制激发条件。此实验模式与共聚焦显微镜成像技术相结合称为Loose_patch方法[3～5]，可对局部诱发钙信号(包括钙火花)进行精确观察。

　　1.5 给药方式

　　FPL64176(10μmol/L)溶于微电极充灌液中，通过玻璃微电极尖端作用于斑片膜上，延长该部位L_型钙通道的开放时间、增大通道开放概率[4， 6]，从而使作为触发信号的内流钙增加，以激发更强的局部细胞内钙的释放。

　　1.6 共聚焦显微镜钙成像

　　本研究采用LSM510共聚焦显微镜系统，配备有波长488nm的氩激光，40倍、1.3NA的油浸镜头。为更好地显示钙信号的时空特征，共聚焦成像一般采用快速线扫描方式[3～5]。时间_空间采样参数分别为：0.77ms/线，0.045μm/象素。线扫描开始一小段时间(约50ms)后即触发膜片钳系统工作，使膜去极化至不同膜电位水平，并持续100ms。所有实验均在室温(23～25℃)条件下进行。

　　1.7 图像处理

　　实验结果均为共聚焦显微镜图像，其处理采用自编程序。编程语言IDL(Research Systems公司，美国)。局部诱发钙信号的幅度以标准荧光强度的净变化(ΔR=ΔF/F0)表示：F0指静息状态下fluo4的背景荧光强度[3_4， 8]。钙火花的平均叠加方法：将钙火花以峰值所在位置为中心，裁取相同大小的钙火花图像，将其叠加平均即得平均钙火花图像。平均局部诱发钙信号的叠加方法：以膜片钳电极尖端在钙图像上的相应位置为中心，裁取相同时间过程的钙信号图像，将其叠加平均即得平均局部诱发钙信号。

　　1.8 统计学处理

　　数据以±s表示;计量资料用Student　t检验，计数资料用卡方检验。

　　2 结果

　　2.1 FPL64176对局部兴奋_收缩耦联概率(δSC)的影响

　　δSC反映局部钙释放被诱发成功的效率，以同一条件下(指相同的膜去极化刺激，以膜电位水平VPM表示，单位mV)成功诱发钙释放的次数占总实验次数的比率用δSC来表示。与对照组比，FPL64176作用下的δSC同样呈“钟形”电压_依赖效应，δSC最高达100%，位于膜电压_10、+5mV处，且相应膜电压水平上的δSC多数较对照组高(P<0.05，图1)。说明增强通过L_型钙通道内流的触发信号可增高δSC。

　　2.2 FPL64176对局部诱发钙火花的影响

　　FPL64176作用下，只有在膜电压水平较低(～_30mV)时，局部诱发细胞内钙释放才有一部分(22/56)以孤立、典型的钙火花形式出现。因而我们只对～_30mV附近的孤立、典型的钙火花进行叠加平均并与对照组结果进行比较。FPL64176作用下，平均局部诱发钙火花的幅度(1.98±0.27，n=22)明显高于对照组(1.07±0.06，n=124)(P<0.05，图2，封2)。

　　2.3 FPL64176对局部平均诱发钙瞬变的影响

　　膜电压水平较高时，由于FPL64176的作用，局部诱发的钙释放很少以孤立、典型的钙火花形式出现。此时的局部诱发钙释放中除了钙火花的成分，可能也有非钙火花成分(包括细胞外内流部分和细胞内钙库释放部分)。这种钙信号可统称为局部诱发钙瞬变。FPL64176作用下，局部诱发钙瞬变的平均峰值同样呈“钟形”电压_依赖曲线，峰值最高处膜电压也同样为+5mV，但在所观察到的各膜电压水平上其峰值均明显高于对照组(P<0.05，图3，封2，图4)。

　　3 讨论

　　实验中用loose patch法可控制局部心肌细胞膜去极化水平，从而研究不同心肌细胞膜去极化水平对细胞内钙信号影响[3， 5]。研究发现，δSC与膜去极化水平的关系呈“钟形”电压_依赖特性;而局部平均诱发钙瞬变与膜去极化水平的关系也呈“钟形”电压_依赖特性。由于局部钙释放是由通过局部L_型钙通道内流的少量钙触发的，其呈电压_依赖特性归根结底是由L_型钙通道的电压_依赖特性所决定的[9]。膜电压水平较低时，L_型钙通道的开放概率较低，但此时推动细胞外钙内流的电化学驱动力较大，离子钙通过通道的单位钙电流较大，此时只要有L_型钙通道开放，就能较有效触发钙火花产生。但由于开放概率较低，总的δSC和局部平均诱发钙瞬变强度均较低。随着膜电压增大，通道开放概率也增大，δSC和局部平均诱发钙瞬变强度也随之增大。当膜电压增大到一定水平后，流经L_型钙通道的单位钙电流明显减弱(此时电化学驱动力明显减小)，因而触发细胞内钙释放的能力有所降低，δSC和局部平均诱发钙瞬变也随之降低。这种特有的“钟形”电压_依赖特性说明，本质上此兴奋_收缩耦联的机制是钙诱导钙释放，而不是由于去极化本身所致。不同性质的L_型钙电流所触发的钙释放表现不同，这有利于进一步研究钙释放的触发机制。

　　FPL64176可明显延长LCCs开放时间和开放概率，增大内向钙电流;因而在不同去极化水平均能更有效地触发局部胞内钙释放。FPL64176作用下，平均局部诱发钙火花幅度明显增大(P<0.05);不同去极化水平的δSC和局部平均诱发钙瞬变的幅度也明显增大。但FPL64176并不影响原有钙释放的“钟形”电压_依赖特性。另外，在我们其他相关实验研究中，还观察到在细胞膜由较高电压的去极化转为复极化时，可产生明显的尾电流反应[6， 10]。但在FPL64176存在下，典型的钙火花较少以孤立形式出现(特别是在膜电压较高时)，而较多表现为局部钙瞬变或先后多个钙峰总和的形式。这可能是由于多个钙火花先后产生、互相融合所致。也不排除其中有非钙火花形式的钙释放[11]。

　　(鸣谢：本研究得到北京大学分子医学研究所程和平教授的热心帮助，特此致以衷心的感谢)

　　【参考文献】

　　[1]BERS D M. Cardiac excitation_contraction coupling[J]. Nature, 2002, 415: 198-205.

　　[2]沈建新, 王海燕, 李超彦, 等. 心肌胞内钙瞬变的记录方法——快速二维扫描法与线扫描法[J]. 中国应用生理学杂志, 2008, 24: 500-503.

　　[3]SHEN J X, WANG S, SONG L S, et al. Polymorphism of Ca2+ sparks evoked from in_focus Ca2+ release units in cardiac myocytes[J]. Biophys J, 2004, 86: 182-190.

　　[4]WANG S Q, SONG L S, LAKATTA E G, et al. Ca2+ signalling between single L_type Ca2+ channels and ryanodine receptors in heart cells[J]. Nature, 2001, 410: 592-596.

　　[5]沈建新, 王世强, 程和平, 等. Loose_patch方法及其诱发的钙火花[J]. 第四军医大学学报, 2004, 25: 677-679.

　　[6]FAN J S, YUAN Y, PALADE P. Kinetic effects of FPL 64176 on L_type Ca2+ channels in cardiac myocytes[J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 2000, 361: 465-476.

　　[7]SONG L S, SHAM J S, STERN M D, et al. Direct measurement of SR release flux by tracking Ca2+ spikes in rat cardiac myocytes[J]. J Physiol, 1998, 512(Pt 3): 677-691.

　　[8]CHENG H, LEDERER W J, CANNELL M B. Calcium sparks: elementary events underlying excitation_contraction coupling in heart muscle[J]. Science, 1993, 262: 740-744.

　　[9]VIATCHENKO K S, GYORKE S. Modulation of the Ca(2+)_induced Ca(2+) release cascade by beta_adrenergic stimulation in rat ventricular myocytes[J]. J Physiol, 2001, 533: 837-848.

　　[10]SHAM J S, SONG L S, CHEN Y, et al. Termination of Ca2+ release by a local inactivation of ryanodine receptors in cardiac myocytes[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998, 95: 15096-15101.

　　[11]CHENG H, WANG S Q. Calcium signaling between sarcolemmal calcium channels and ryanodine receptors in heart cells[J]. Front Biosci, 2002, 7: d1867-1878.