骨骼肌条肌质网Ca2+释放功能的间接测量方法

　　【摘要】 目的 本实验拟建立测量骨骼肌肌质网(SR)钙离子释放功能的简便方法。方法 分析大鼠离体比目鱼肌肌条间断强直收缩张力峰值到75 %恢复的时间(TR75), TR75呈先延长然后缓慢缩短。以延长至最大时的TR75除以第一次强直收缩的TR75，获得TR75延长比值(RTR75)。结果 增加刺激电压或用5 mmoL/L Caffeine灌流(增加SR Ca2+释放通道开放几率)比目鱼肌肌条，RTR75从对照组的2.5倍均增加到3.0倍。相反，5 mmol/L硫酸镁灌流抑制SR Ca2+释放通道，使RTR75明显减小。 间隔60 min的2次间断强直疲劳收缩，其RTR75间无明显差别，但间隔5或10 min，再次进行间断强直疲劳收缩期间的RTR75呈显著减小。萎缩比目鱼肌间断强直疲劳收缩期间，RTR75增加2.9倍，明显高于对照组。结论 比目鱼肌肌条间断强直疲劳收缩期间，在肌质网Ca2+ATP酶活性没有改变的条件下，TR75延长比值可间接反映SR钙释放功能。另外，去负荷2周萎缩比目鱼肌的RTR75增加提示其SR钙释放功能可能增强。

　　【关键词】 失重模拟;尾吊;肌质网;钙释放;TR75

　　Indirect Evaluation of Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ Release Function in Skeletal Muscle Strips.SHENG JuanJuan, LI Quan, YU Zhibin. Space Medicine & Medical Engineering,2010,23(1):10～14

　　Abstract：Objective To set up a simple method to measure the SR Ca2+ release function in skeletal muscle strips. Methods The time from peak tension to 75 % relaxation (TR75) during intermittent tetanic contraction(fatigue contraction) of isolated musculus soleus strips was analyzed. It was prolonged rapidly, and then shortened slowly. The ratio of maximal TR75 to initial TR75 (RTR75) indicated a balance between SR Ca2+ release and uptake. If the SR Ca2+ATPase (SERCA) activity and inhibition extent of SERCA in fatigue contraction were identical, RTR75 should be an index for SR Ca2+ release function.Results Higher stimulation voltage or 5 mmol/L caffeine perfusion which increased the SR Ca2+ release channel open probability induced an increase of RTR75 from 2.5 in control to 3.0. On the contrary, inhibition of SR Ca2+ release with 5 mmol/L magnesium sulfate perfusion significantly decreased RTR75.Inhibition of SR Ca2+ release by metabolites during fatigue contraction was recovered slowly. So RTR75 at the second fatigued contraction was reduced after 5 or 10 min of recovery, but no significant difference after 60 min of recovery. During intermittent tetanic contraction RTR75 was increased to be 2.9 times of normal in unloaded soleus. Conclusion The above results suggest that RTR75 during muscle strip fatigue contraction without any change of SERCA activity can indirectly reflected SR Ca2+ release function. In 2week unloaded soleus, the enhanced RTR75 indicates an increase in SR Ca2+ release function.

　　Key words:weightlessness simulation;tail suspension;sarcoplasmic reticulum; calcium release;TR75

　　Address reprint requests to:YU Zhibin.Department of Aerospace Physiology,The Fourth Military Medical University, Xi’an Shannxi 710032, China

　　骨骼肌肌质网(SR)的Ca2+转运功能，是兴奋-收缩偶联的中心环节，它也是将电兴奋信号经Ca2+转换成力学信号的重要一环。因此，肌质网钙离子通道(Ryanodine受体)释放Ca2+与Ca2+-激活ATP酶(SERCA)摄取Ca2+的功能一直是本领域的研究热点。SR钙离子释放功能可采取膜片钳技术，在纯化的SR小囊泡或表达SR钙释放通道的人工膜上，观测其通道开放概率、电导与开放持续时间等[1]。也可以采取Ca2+荧光指示剂通过细胞内钙瞬变峰值与持续时间来判断SR的Ca2+的释放功能[2]。还有采取45Ca示踪法，观测在刺激条件作用下，单位时间内Ca2+释放的量来比较SR的Ca2+释放功能[3]。另有采用放免受体分析技术，用H3ryanodine分析雷咯啶受体(即SR钙释放通道)的功能[3]。在通透细胞膜的条件下，用笼锁化合物(caged compound)模拟细胞内Ca2+诱导的Ca2+释放，观测SR钙释放通道功能[4]。SR摄取Ca2+的功能则多采用直接的酶活性测量与45Ca摄取实验来观测[5]。但是，这些方法大部分是在非完整肌纤维或细胞上进行观测，受诸多测试因素的影响，有时不能反映在体肌纤维SR钙转运的实际功能。另一方面，这些实验方法技术难度高，操作不当即可引起数据出现较大的变异，可能掩盖真实的实验变化。在离体肌条灌流条件下，本实验室利用肌肉收缩后，以张力峰值降低75 %所需时间(TR75)这一指标，来判断SERCA的Ca2+摄取功能[6]。

　　本研究则在离体肌条灌流条件下，增强或抑制SR钙释放通道的Ca2+释放，通过分析疲劳性强直收缩期间TR75的变化，建立间接判断SR钙释放通道功能变化的规律，进而观测尾部悬吊2周去负荷萎缩比目鱼肌SR钙释放通道功能的变化。

　　1 方法

　　1.1 实验动物与后肢去负荷大鼠模型

　　选用健康雄性SpragueDawley大鼠，体重180～210 g，鼠龄约2个月，由第四军医大学实验动物中心提供。按体重配对原则, 分为同步对照和尾部悬吊2周组，每组6只大鼠。按本实验室已建立的方法进行动物饲养与尾部悬吊[7], 定期称重。在14 d取尾部悬吊大鼠及数目相等的配对饲养对照大鼠的比目鱼肌标本。单纯采用对照组进行实验时，6条肌肉来自6只大鼠的随机一侧，另一侧的肌条用于另一作用条件。

　　1.2 离体肌条灌流技术与收缩功能测量

　　采用本实验室已建立的方法进行[7]，其主要步骤为：戊巴比妥钠(50 mg/kg体重)腹腔注射麻醉大鼠，约10 min后，迅速剪开后肢小腿皮肤，充分暴露肌肉后，将两侧肌肉筋膜剪开。尽量在远心端剪断跟腱，轻柔地游离出比目鱼肌(SOL)。将游离的SOL放置于Krebs液中，顺肌纤维方向沿纵轴剪下宽度约为1 mm的全长肌条。用0号线行近心端肌腱结扎后，水平放置于肌肉灌流系统的肌肉槽中;近心端用0号线结扎固定于等长张力传感器(TB651，日本光电)，远心端则采用弹簧夹固定于肌槽的另一端。采用KrebsHenseleit溶液按6 mL/min行非循环灌流。灌流液组成(mmol/L)：120.0 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 NaH2PO4, 1.2 MgSO4, 2.5 CaCl2，0.25 EDTA，20.0 NaHCO3, 10.0 glucose。以95 % O2和5 % CO2的混合气体充分氧合, 使pH维持在7.40±0.20。采用铂金丝场刺激。电刺激器( SEN3301, 日本光电)输出脉宽500 μs、25 V、间隔 20 s的正向方波单收缩刺激，以0.1 mm增量, 逐步拉伸比目鱼肌至等长收缩张力为最大时的肌肉初长 Lmax位置, 平衡10 min。然后改用100 Hz刺激频率、50 %工作负荷(Duty cycle，DC)的间断强直收缩刺激(以1 000 ms 作为一个间断强直收缩周期，其中电刺激引起强直收缩的时间为500 ms ，休息时间间隔为500 ms，则定义其DC为50%)，收缩间隔60 s，平衡20 min后，采用30 % DC的间断强直收缩，平衡10 min。将收缩间隔缩短为1 s，进行间断强直疲劳收缩5 min，延长间断强直收缩间隔至60 s，第1组肌条在恢复5 min或10 min后，再进行5 min间断强直疲劳收缩。第2组肌条在恢复60 min后，分别加入5 mmol/L Caffeine或MgSO4灌流10 min，再进行5 min间断强直疲劳收缩。第3组肌条在恢复60 min后，改变刺激频率为120 Hz或140 Hz，或者不改变刺激频率仅升高刺激电压至45 V，分别作用10 min，再进行5 min间断强直疲劳收缩。采用Chart软件(AD Instruments, Australia)记录与分析肌条间断强直收缩参数。按本实验室已建立的方法测量间断强直收缩疲劳期间TR75的变化[6]，以TR75延长的最大值除以疲劳开始时第一次强直收缩的TR75值，获得TR75延长比值，即ratio of maximal TR75 to initial TR75。

　　实验结束后, 用滤纸吸干肌肉表面附着的水分并称重。再按文献[7]公式计算每一肌肉的横截面积(CSA)。

　　1.3 统计分析

　　将各实验组数据以x±s表示，使用SPSS10.0统计软件对随机区组设计资料进行t检验分析。P<0.05为检验显著性水平。

　　2 结果

　　2.1 增加刺激电压或Caffeine灌流使TR75延长比值增大

　　〖HT5SS]图1上图为肌条疲劳性间断强直收缩5 min的典型图，包含300次间断强直收缩，在5 min收缩期内，收缩张力峰值逐渐降低。下图为每隔10 s测量强直收缩的TR75值，在疲劳收缩期间，TR75迅速延长，在1.5 min达峰值，然后缓慢缩短。

　　在25 V刺激电压作用下，肌条强直收缩张力基本达到最大值，进一步增加刺激电压，强直收缩张力峰值增加幅度较小(<1 %)，至45 V强直收缩张力不再增加。在25 V刺激电压作用下，疲劳性间断强直收缩期间，对照组比目鱼肌肌条TR75延长比值为2.6倍，45 V刺激电压作用条件下，TR75延长比值为近3.0倍，两组均值间具有非常显著性差别(P<0.01，图2)。25 V刺激电压作用下，5 mmol/L Caffeine灌流时，TR75延长比值亦达3.0倍，较Con 25 V组亦明显增大(P<0.01)。

　　2.2 在相同工作负荷下，增加刺激频率不影响TR75延长比值

　　工作负荷为30 %，刺激电压25 V，刺激频率100 Hz作用时，疲劳性强直收缩期间TR75延长比值为2.5倍;120 Hz下，TR75延长比值为2.7倍;140 Hz下，TR75延长比值为2.3倍。3组均值间无显著性差别(P>0.05，图3)。

　　2.3 硫酸镁灌流降低TR75延长比值

　　工作负荷为30 %，刺激电压25 V，刺激频率100 Hz作用，与对照组TR75延长比值2.6倍相比，采用5 mmoL/L Mg2SO4灌流15 min或60 min后，进行间断强直疲劳收缩，TR75延长比值均为2.1倍，呈非常显著的减小(P<0.01，图4)。

　　2.4 缩短恢复间隔降低TR75延长比值

　　工作负荷为30 %，刺激电压25 V，刺激频率　**P<0.01,as compared with control value 100 Hz作用比目鱼肌肌条，第一次疲劳性强直收缩时，TR75延长比值为2.6倍;经60 min恢复后，第二次疲劳性强直收缩期间的TR75延长比值为2.4倍，与第一次无显著差异(P>0.05，图5)。当缩短恢复时间为5 min或10 min，第二次疲劳性强直收缩期间的TR75延长比值分别为1.4倍与1.9倍，与第一次形成非常显著性差别(P<0.01，图5)。

　　2.5 去负荷萎缩SOL的TR75延长比值增大

　　同步对照组比目鱼肌肌条，在30 %工作负荷，25 V刺激电压，100 Hz刺激频率作用下，间断强直收缩的TR75均值为133.9 ms;相同条件下，去负荷2周萎缩比目鱼肌肌条间断强直收缩的TR75均值为125.3 ms，两者间未见显著性统计学差别(P>0.05)。而在疲劳性间断强直收缩期间，去负荷萎缩比目鱼肌的TR75延长比值为2.9倍，较对照组TR75延长比值2.4倍显著增大(P<0.01，图6)。

　　3 讨论与结论

　　3.1 疲劳期间TR75延长比值可以间接反应SR钙释放功能

　　肌纤维或肌条在单次收缩(twitch contraction)或强直收缩时，TR75的长短与肌质网Ca2+ATP酶活性密切相关[6]，同时也受强直收缩期间肌质网释放的Ca2+量的影响，是两者平衡的结果。比目鱼肌肌条在间断强直收缩的疲劳期，其强直收缩的TR75逐渐延长，然后缩短(图1)。这一现象反映了SOL肌质网Ca2+ATP酶活性首先被肌纤维内代谢产物抑制，而肌质网钙释放功能被抑制发生较晚[8]，故呈现TR75逐渐延长;当代谢产物对肌质网钙释放功能的抑制程度增加时，TR75则转向缩短。在相同条件的间断强直收缩疲劳期间，对肌质网Ca2+ATP酶活性的抑制是相同的，所以，TR75延长比值应该基本相同。如果在间断强直收缩疲劳期增加SR钙释放，则会导致TR75延长的比值增加。如Caffeine与增加刺激电压均可增加SR钙释放，因此使TR75延长比值增大(图2)[9]。当刺激频率达100 Hz后，SR钙释放达最大，进一步增加刺激频率至120 Hz或140 Hz，SR钙释放未能进一步增加，故3种刺激频率下，疲劳性强直收缩期间的TR75延长的比值之间未见显著性差别。相反，减少间断强直收缩疲劳期的SR钙释放，则可降低TR75延长比值。本实验中采用高镁离子浓度灌流，可抑制SR钙释放[10]，使发展张力降低，同时也使间断强直收缩疲劳期的TR75延长比值减小(图4)。由于强直收缩疲劳后，SR钙释放功能恢复较慢[8]，故采用5 min与10 min的恢复间隔后再进行疲劳性间断强直收缩，前一次疲劳收缩后SR钙释放功能的抑制并未恢复，故TR75延长比值明显下降(图5)。当恢复期延长为60 min，前一次疲劳强直收缩对SR钙释放功能的抑制作用基本解除，故再次进行疲劳强直收缩时，其TR75延长比值亦恢复至第一次疲劳收缩的水平。这样采用增加或减少肌质网钙释放功能的方法，表明在肌质网Ca2+ATP酶活性不变时，TR75延长比值随肌质网钙释放功能增强而增大，肌质网钙释放功能降低而减小。另一方面，疲劳性间断强直收缩期间代谢产物亦可抑制肌原纤维对Ca2+的亲合力，当肌原纤维对Ca2+的亲合力降低时，如果肌质网Ca2+ATP酶活性不变，TR75应该缩短。但是，恰恰相反，在疲劳性间断强直收缩期间，TR75早期是延长的(图1)，故肌原纤维对Ca2+亲合力的影响可以排除。

　　综上所述，在骨骼肌肌条收缩负荷、灌流液温度、刺激电压、刺激方波的波宽与疲劳收缩时间保持不变的条件下，疲劳性间断强直收缩期间TR75延长比值可以间接地反映SR钙释放功能。由于本实验中仅采用经过钙荧光观测，已证明肌质网钙离子释放功能增强或减弱的实验条件，如Caffeine灌流、增加刺激电压或高镁离子灌流等，但并未采用钙荧光方法同步测量肌质网钙离子释放功能的变化，故TR75延长比值存在一定的局限性，只能作为初步判断肌质网钙离子释放功能变化趋势的前期指标而被应用。

　　3.2 去负荷2周比目鱼肌SR钙释放功能增强

　　在相同灌流条件下，尾部悬吊去负荷2周萎缩SOL在30 %Duty cycle下，强直收缩的TR75值与对照组间无差别，表明其肌质网Ca2+ATP酶活性未发生明显改变。但是，在疲劳性强直收缩期间，TR75延长比值明显增加(图6)，提示其SR钙释放功能增强。萎缩比目鱼肌肌原纤维对Ca2+的亲合力是降低的[11]，TR75延长比值的增加更能表明其SR钙释放功能增强。萎缩SOL出现由慢缩型肌纤维向快缩型的转化，其肌质网钙离子释放通道(Ryanodine受体，RyR)也发生向RyR1的转化[11]。有研究表明，在强直收缩时，快缩型肌纤维SR钙离子通道释放的量大于慢缩型肌纤维[12]。故萎缩SOL肌纤维发生慢向快缩型的转型，其肌质网钙释放功能应是增强的。在灌流的离体骨骼肌肌条，采用TR75延长比值这一指标，可反映出萎缩比目鱼肌肌质网钙释放功能的增强，表明该指标虽为一个间接指标，但具有一定的实际应用价值。

　　总之，本实验结果表明：比目鱼肌肌条间断强直疲劳收缩期间的TR75延长比值是描述肌质网钙释放功能的简便方法。通过对去负荷2周萎缩比目鱼肌的检测，提示可用该指标对骨骼肌肌质网钙释放功能的变化进行初步的方向判断，为采用更精确的方法进行观测奠定基础。

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