用荧光强度反映Cbfa1活性成骨细胞模型的构建

　　【摘要】 目的 构建稳定表达由6OSE2启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的MG63细胞株，并筛选出能反映Cbfa1活性的细胞株。方法 合成6OSE2启动子的序列，并将其构建到T载体中;然后通过双酶切得到启动子片段;与去除CMV启动子的报告基因载体pEGFPN1的酶切片段连接，构建真核表达载体;并转染到MG63细胞系，经G418筛选得到了稳定转染6OSE2EGFP基因的MG63细胞株。用不同浓度的IGFI和VD3处理，通过EGFP荧光强度分析，ALP活性测定，筛选出能够响应IGFI和VD3的细胞株。结果 构建了pUC6OSE2扩增载体和p6OSE2EGFP真核表达载体，通过稳定转染以及IGFI、VD3筛选获得一株荧光强度随IGFI和VD3处理而增强的细胞株OSEMG63。结论 构建了能反应Cbfa1活性的成骨细胞模型，为进一步研究微重力对Cbfa1的转录活性及信号传导途径的影响奠定了基础。

　　【关键词】 成骨细胞;6OSE2;MG63;基因表达;荧光强度

　　Establishment of an Osteoblastic Model Reflecting Cbfa1 Activity with Fluorescent Intensity.TONG Feifei, DAI Zhongquan, GUO Feima, DING Bai, TAN Yingjun, LV Jinyin, LI Yinghui.Space Medicine & Medical Engineering,2010,23(1):15～19

　　Abstract: Objective To obtain MG63 cell lines which are stably transfected with enhanced green fluorescent protein(EGFP) reporter gene drived by 6OSE2 promoter and select the cell strain which can reflect Cbfa1 activity by EGFP fluorescence. Methods 6OSE2 promoter was synthesized and cloned into pUC57T vector. The 140 bp promoter fragment inserted into deleted CMVpromoter pEGFPN1 vector to construct eukaryotic expression vector. MG63 cell was transfected with this vector by Lipofectamine 2000 and stably selected by G418. Analysed the EGFP fluorescence intensity of the stably transfected MG63 cell stain and detection of ALP activity after treatment with different concentration of IGFI or VD3，then selected one which could reflecting Cbfa1 activity. Results The pUC6OSE2 vector and p6OSE2EGFP expression vector were constructed. Through stably transfection and selection, one OSEMG63 cell strain was gained,which fluorescence intensity could reflect the treatment of IGFI or VD3. Conclusion The osteoblastic model which can reflect Cbfa1 activity is established successfully. This cell line will be useful for studying the effects of microgravity on the activity of Cbfa1 and the signal pathways related with bone form.

　　Key words: osteoblast;6OSE2;MG63;gene expression;fluoresent intensity

　　Address reprint requests to:LI Yinghui.State Key Lab of Space Medicine Fundamentals and Application, China Astronaut Research and Training Center, Beijing 100094, China

　　空间飞行导致航天员的骨矿物质呈进行性、持续性丢失;其发生的主要原因是成骨细胞对相关细胞因子的响应性下降、分化功能降低，进而造成骨形成减少[1]。空间和地面实验证实微重力环境下骨祖细胞和前成骨细胞的分化抑制主要是由于Cbfa1的活性下降造成[24]，但微重力环境下其活性调控机制尚不十分清楚。

　　Cbfa1是成骨细胞特异性的关键转录因子。

　　它的缺失可导致成骨细胞分化完全受抑制，使骨骼的软骨内成骨和骨内膜成骨均不能发生[5]。Cbfa1不仅控制成骨细胞分化和骨形成，而且还影响软骨细胞、破骨细胞分化和血管侵入[6]。Cbfa1还是一个重要的机械力信号传导的靶标分子，其表达和活性的变化是调控成骨细胞活性和分化的“中枢点”[7]。在正常重力情况下，力刺激能激活多条胞内信号通路，如MAPK、PI3K、Smads等，进而调节Cbfa1的表达和活性，影响成骨细胞的分化成熟[811]。Cbfa1是通过与成骨相关基因启动子区域内的CCAACCACA序列(OSE2位点)结合，调节它们的表达[12]，从而启动未分化的间质细胞或使已分化的其他类型细胞向成骨细胞方向分化。但是力刺激如何调控Cbfa1活性有待进一步深入研究，从而揭开空间骨丢失的奥秘。

　　为此，我们构建了由串联6个Cbfa1作用元件(OSE2)的OC最小启动子(6OSE2)控制的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体，并稳定转染到前成骨细胞系MG63细胞中。通过IGFI和VD3等细胞因子筛选，建立能够反映Cbfa1活性的细胞模型;这个模型可用于空间和地面细胞学实验研究，为进一步研究微重力对Cbfa1的表达和转录活性的调节机制奠定基础。

　　1 方法

　　1.1 材料

　　MG63细胞由本实验室保存;FBS(PAA, 奥地利)，DMEM，胰蛋白酶 (Gibco,德国)，LipofectamineTM2000(Invitrogen，美国);pEGFPN1(Clontech, 美国);Taq酶，DNA片段凝胶回收试剂盒，质粒回收试剂盒，感受态细胞E.ColiDH5α(Tiangen, 中国);限制性内切酶Ase I，BamH I，Bgl II (NEB, 美国);G418(Amresco, 美国);碱性磷酸酶试剂盒(南京建成);IGFI，1,25(OH)2Vitamin D3 (Sigma, 美国)。

　　1.2 6OSE2基因启动子扩增

　　用荧光强度反映Cbfa1活性成骨细胞模型的构建根据文献报道[12]，设计并合成6OSE2启动子的两条序列：P1:GGTACCATTAATACGTAAGATCTCCAACCACACCAACCACACCAACCACACCAACCACACCAACCACACCAACCACAGCCGATATAAATGCTACTGG; P2:CGGGATCCGACTTGTCTGTTCTGCACCCTCCAGCATCCAGTAGCATTTATATCGGC，它们之间有部分序列是互补的(加粗)，将其退火后，用Taq酶进行扩增。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离目的片段(140 bp左右);用DNA片段凝胶回收试剂盒回收该片段;然后与pUC57T载体进行连接，转化到感受态细胞 E.Coli DH5α中，利用T载体上的氨苄抗性和蓝白斑系统，筛选获得准阳性克隆，用T载体上的通用引物对其进行基因测序，测序工作由上海旭冠生物科技发展有限公司完成。

　　1.3 p6OSE2EGFP表达载体构建

　　在获得含6OSE2启动子的扩增载体pUC576OSE2后，利用质粒回收试剂盒大量提取该克隆的质粒，分别用Ase I和BamH I双酶切，获得长度为140 kb左右的短片段;同时用Ase I和Bgl II酶切pEGFPN1载体，获得长度为4.4 kb、删除CMV启动子的表达载体主片段。经过凝胶电泳分离和DNA片段凝胶回收试剂盒分别回收这两个片段。由于Bgl II和BamH I酶切后具有相同的末端序列，因此可以进行连接。按摩尔数比例1∶3混合，添加连接酶反应体系，4 ℃反应过夜后，转化到感受态细胞中，利用卡那抗性筛选阳性克隆。进行基因测序鉴定，获得6OSE2启动子驱动荧光报告基因的表达载体(p6OSE2EGFP)。

　　1.4 OSE2MG63稳定转染细胞株的筛选

　　在获得p6OSE2EGFP表达载体后，利用无内毒素质粒大量提取试剂盒抽提该质粒;紫外分光光度计测定质粒的OD260/OD280及质粒的浓度。在六孔板中接种(1～3)×105个细胞，培养至细胞达到50%～80%的满度。按LipofectamineTM2000转染试剂盒操作步骤，将p6OSE2EGFP转染入MG63细胞中。细胞转染48～72 h后，以含600 μg/mL G418的选择性低糖DMEM培养基按1∶10传代，每2～4 d用选择性培养基换液1次，持续3～4周，得到阳性克隆。挑取荧光较强的几个细胞克隆团，通过局部胰酶消化后进行极限稀释法筛选单细胞克隆。最后扩大培养，获得的细胞株命名为OSEMG63。

　　1.5 OSEEGFP稳定细胞株荧光强度分析

　　在六孔板中放入血盖片，接种(1～3)×105个细胞，加2 mL细胞培养液。细胞贴片后，加入不同浓度的IGFI(50、100、200 ng/mL)和VD3(0.1、0.2、0.4 μmol/L)处理，培养2 d后，取下细胞片，收集培养液，细胞用PBS清洗2次，加入约2 mL 4%多聚甲醛，固定30 min，倒掉固定液，用PBS清洗数次。在倒置荧光显微镜下，选择合适的滤光片模块，设定相同的gama值、曝光时间、gain值等拍照参数，采集荧光图像，用NIH开发的ImageJ软件分析荧光强度。

　　1.6 ALP活性测定

　　取1 mL培养液浓缩后，用50 uL水溶解，然后按照碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒说明，测定碱性磷酸酶活性。

　　2 结果与分析

　　2.1 6OSE2基因启动子扩增

　　用PCR方法从两段部分互补的引物中扩增出140 bp左右的6OSE2启动子，并与pUC57T载体构建了pUC576OSE2。进行基因测序(图1)，用DNAman软件比对测序获得的序列与设计序列，结果表明所扩增的序列与设计序列相一致，可用于下一步研究。

　　2.2表达载体的鉴定结果

　　双酶切pUC576OSE2，获得长度为140 bp的6OSE2启动子片段。该片段与删除CMV启动子的表达载体pEGFPN1片段连接，经卡那筛选后进行基因测序。测序结果(图2)表明片段连接正确，即获得p6OSE2EGFP真核表达载体。

　　2.3 稳定转染6OSE2EGFP基因细胞株的筛选

　　上述表达载体在转染入MG63细胞后，用G418筛选3～4周，再经极限稀释法筛选，获得了几个克隆细胞株。筛选出来的OSEMG63细胞株克隆团具有较强的荧光，说明扩增出来的6OSE2启动子能够启动EGFP基因表达;构建的表达载体能够在MG63细胞中正确表达。

　　2.4 OSEMG63细胞株对骨向诱导剂的响应

　　在倒置荧光显微镜下，选择合适的滤光片模块，随机观察血盖片上不同部位的细胞，对不同浓度IGFI和VD3处理的细胞进行荧光图像采集(图3)。通过软件分析选定细胞区域的平均荧光强度值;结果发现OSEMG63细胞的荧光强度随IGFI剂量的增加有明显的增强(图3);用VD3处理OSEMG63细胞也有同样效果(图4)。碱性磷酸酶活性测定结果表明在加入IGFI和VD3处理之后，细胞培养液中ALP的活性随加药剂量增加而升高(图5)，这与OSEMG63细胞的荧光强度变化趋势相一致。

　　3 讨论

　　本实验成功转染并筛选出整合有6OSE2EGFP基因的细胞株。筛选出来的细胞株经多次反复冻存、复苏和传代，EGFP基因表达基本稳定，相同条件处理的OSEMG63细胞荧光强度基本均一。这证明扩增出来的6OSE2启动子能够启动EGFP基因表达;构建的表达载体能够在MG63细胞中正确稳定表达。利用前期建立的基于图像荧光强度分析的启动子活性分析方法[13]，用不同浓度的IGFI和VD3处理筛选出来的细胞株，证实该细胞株的荧光强度随着IGFI和VD3浓度增加而增强，证实该细胞株的荧光强度变化能够指示OSE2启动子活性变化和MG63细胞骨向分化。

　　成骨细胞分化成熟和骨骼形成是受一系列细胞因子和物理机械刺激及其相关信号通路调节的。IGFs是骨组织中调控成骨细胞分化的主要生长因子，IGFI与细胞膜上的受体IGFIR结合，磷酸化IRS1/2，后者将信号传递给PI3KAkt或RasMAPK，最终影响成骨细胞的增殖分化。IGFs及其信号传递分子IGFIR、IRSs的缺失都能导致骨质疏松发生[14]。Qiao等[15]发现IGFI及其受体能够调节Cbfa1转录后的修饰，通过PI3K/Pak1 图1 pUC576OSE2载体的测序结果图和ERK1/2 信号级联激活Cbfa1的DNA结合活性。实验中，静止培养的OSEMG63细胞加入不同浓度的IGFI处理2 d，显著地提高了由6OSE2启动子启动的EGFP报告基因活性，细胞荧光强度明显增强，表明Cbfa1转录活性提高。在微重力环境中，由于力刺激的减少可使骨骼对IGFI产生拮抗作用[16]，暗示微重力能够阻断IGFI信号传导，但微重力对Cbfa1活性及IGFI信号通路的调控机制尚不清楚，OSEMG63细胞模型的建立为进一步深入研究奠定基础。

　　1,25(OH)2Vitamin D3是一种类固醇钙调节激素，它是调节多种骨相关基因表达的系统性的生长因子。通过抑制细胞增值和加强成骨相关基因表达，进而调节成骨细胞分化、成熟、定型，影响骨骼的新陈代谢[17]。VD3与细胞核内的受体VDR结合，通过2种方式改变相关基因表达：1)与基因启动子上的反应元件VDRE结合;2)与其他转录因子或染色质修饰蛋白结合，从而调节他们的转录活性。VD3能够刺激成骨相关基因表达，比如I型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素及成骨细胞特异性转录因子Cbfa1、Osterix等等[18]。VD3除了能促进Cbfa1的表达外，VDR还能和Cbfa1直接相互作用，调控靶基因的表达[1920]。本研究通过荧光强度分析也证实VD3能够增强Cbfa1活性，与前面报道结果一致。

　　碱性磷酸酶(ALP)是反应成骨细胞分化表型特征的主要蛋白，在成骨细胞早期分化中诱导产生[21]。ALP表达水平及活性可作为细胞骨向分化程度的标志。实验中，IGFI或VD3的处理均提高了OSEMG63细胞的ALP活性。这与反应Cbfa1活性的EGFP荧光强度的增强相一致，表明IGFI或VD3的加入提高了Cbfa1的转录活性，从而促进OSEMG63细胞的成骨向分化。

　　本实验建立的OSEMG63细胞模型，用荧光强度反应Cbfa1活性。在采集不同处理细胞的荧 图5 不同浓度IGFI和VD3处理的OSE2MG63细胞ALP活性变化(n=3)

　　光图像后，细胞样品还可继续用来做蛋白、RNA等其他指标的分析，从有限的样品中获得更多信息，从而为航天细胞搭载实验提供一种更方便有效的反应Cbfa1活性的细胞模型，为进一步研究微重力影响成骨细胞分化进程中的作用机理奠定基础。

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