在Fas和放线菌素D诱导Bel7402细胞凋亡中激活的caspase8调节Bcl2表达

　　【摘要】 目的 探讨在Fas和放线菌素 D(actinomycin D，AD)诱导Bel7402细胞的凋亡过程中， 激活的caspase8是否调节Bcl2表达。方法 取对数生长的细胞随机分组实验:对照组、Fas组、FasAD组、caspase8抑制剂AcIEFDcho组。在Bel7402细胞中添加或不添加caspase8的抑制剂(AcIEFDcho)，然后加入Fas和AD。通过电镜观察细胞的超微结构，通过Westernblot和RTPCR检测caspase8和Bcl2 表达。结果 与对照组比较，在Fas和放线菌素 D作用下，细胞凋亡的形态结构清晰可见，激活的caspase8表达增加，同时Bcl2表达降低;然而在AcIEFDcho抑制剂作用下，激活的caspase8表达减少，Bcl2表达增加。结论 在Fas和放线菌素 D诱导Bel7402细胞的凋亡过程中，激活的caspase8能调节Bcl2表达。

　　【关键词】 跨膜受体蛋白; caspase8; Bcl2; 细胞凋亡

　　Activated Caspase8 Regulates Bcl2 Expression in Fas and Actinomycin Dinduced Apoptosis in Bel7402 Cells.WANG Lu,WANG Yu, XIA Chunhui.Space Medicine & Medical Engineering,2010,23(1):31～34

　　Abstract：Objective To investigate whether caspase8 regulates Bcl2 expression in Fas and Actinomycin D (AD) induced apoptosis in Bel7402 cells. Methods Bel7402 cells were divided into four groups randomly,that is:control,Fas group,FasAD group and AcIEFDcho group,and treated with FasAD in the presence/absence of caspase8 inhibitor AcIEFDcho. The expressions of caspase8 and Bcl2 were determined with Western Blot and RTPCR, respectively. Results Compared with control group and Fas group, after Bel7402 cells were treated with FasAD, typical apoptosis morphology was clearly observed, the expression of activated caspase8 increased significantly, and the Bcl2 expression decreased apparently. However, after Bel7402 cells were treated with FasAD in the presence of the caspase8 inhibitor AcIEFDcho, the expressions of activated caspase8 decreased while the Bcl2 expression increased. Conclusion Activated caspase8 can regulate Bcl2 in Fas and AD induced apoptosis in Bel7402 cells.

　　Key words: Fas; caspase8; Bcl2; cell apoptosis

　　Address reprint request to:WANG Yu. Qiqihar Medical College,Haerbin Heilongjiang 161006,China

　　在各种疾病如癌症、自身免疫、不规则的神经变性和生理细胞死亡中，细胞凋亡起到重要作用，并且许多因子都卷入死亡信号中[1]。细胞凋亡是细胞自身维持内环境稳态平衡的一种程序性自杀机制, 其信号途径可分为死亡受体途径和线粒体途径。跨膜受体蛋白(Fas)是死亡受体途径中最重要的分子之一 [2]。在正常的鼠和人的肝中，发现Fas不断表达，添加antiFas抗体可导致鼠或人的肝细胞凋亡[3], 所以Fas/FasL 系统作为肿瘤治疗的一个潜在靶子，不仅对于组织细胞的限制或肿瘤细胞的增殖，而且对于免疫反应的下游调节来说，Fas/FasL 系统是一个生理性关键 [46]。

　　在Fas诱导的肝细胞凋亡过程中，在细胞凋亡的中心控制和效应阶段，最重要的事件是发生caspase的活化，其中caspase8的活化直接或间接引起细胞凋亡结构特征的出现[7]。此外，具有抗肿瘤作用的放线菌素D(actinomycin D,AD)也日益受到科学家的重视[8]，通过AD处理细胞，能激活细胞内信号，使对Fas抗体介导的凋亡不敏感的细胞株变得敏感，在诱导凋亡过程中提供了与Fas协同的共刺激信号，从而促进细胞凋亡。然而目前有关Fas和AD 诱导Bel7402细胞凋亡机制的研究还鲜见报道，本课题组前期工作已经证实Fas(6 μmol/L)和AD(20 μmol/L) 能诱导Bel7402细胞凋亡，凋亡率为39.78%，并且随Fas抗体浓度增加凋亡率增加，而caspase8的抑制剂AcIEFDcho可以部分抑制这种凋亡现象，所以本研究进一步探讨Fas抗体和AD 诱导Bel7402细胞凋亡的作用机理，激活的caspase8是否调节Bcl2的表达，为下一步与线粒体途径关系的研究做铺垫。

　　1 方法

　　DMEM培养基购自美国Gibco公司; Fas，caspase8, Bcl2 和 βactin 抗体和二抗购自美国Santa Cruz公司;Actinomycin D(AD) 购自 CalBiochem;Trizol 购自Invitrogen公司;Bel7402细胞购自中科院动物研究所。

　　1.1 细胞培养

　　将 Bel7402细胞培养在含10%小牛血清的DMEM 培养液中，加入青霉素100 U/L 、链霉素100 mg/L，置37 ℃、5 %CO2培养箱内培养。

　　1.2 分组实验

　　第1期 王 璐，等.在Fas和放线菌素D诱导Bel7402细胞凋亡中激活的caspase8调节Bcl2表达取对数生长期的细胞随机分4组实验：对照组;Fas组;FasAD组;caspase8抑制剂AcIEFDcho组。在对照组中Bel7402细胞未被处理。在Fas组中Bel7402细胞中添加Fas(6 μmol/L)，作用24 h。在FasAD组中Bel7402细胞中添加Fas(6 μmol/L)和AD(20 μmol/L)，作用24 h。在AcIEFDcho组，在Bel7402细胞中添加caspase8抑制剂AcIEFDcho (10 μmol/L)作用1 h后，添加Fas(6 μmol/L)和AD(20 μmol/L)，作用24 h。

　　1.3 电镜标本制作

　　透射电镜检测细胞凋亡形态,细胞分别以2.5%戊二醛固定,梯度丙酮脱水,锇酸固定，包埋制作超薄切片于透射电镜下观察。

　　1.4 Westernblot

　　收集细胞提取总蛋白; 用Lowry法测定含量后, 取总蛋白30 μg经120 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移至硝酸纤维素膜上。用含50 g/L奶粉的TBST室温封闭1 h;分别加1∶400稀释的兔抗人caspase8、Bcl2与βactin 抗体，室温孵育2 h;用TBST漂洗10 min×3次;加1∶5 000稀释的过氧化物酶结合的二抗，室温孵育1 h;用TBS漂洗10 min×2次， TBST漂洗1次，ECL发光[9]。

　　1.5 RTPCR

　　PCRs 反应条件 35 cycles，变性 30 s，94℃，退火30 s，54 ℃ 延伸 1 min 72 ℃，另加延伸 10 min 72 ℃。caspase8 引物序列 (5’3’) F CGC AAA GGA AGC AAG AAC,R TTG AGC CCT GCC TGG TGT，βactin引物序列 (5’3’) F TCC TCC TGA GCG CAA GTA CTC T , R GCT CAG TAA CAG TCC GCC TAG A，PCR产物进行15 g/L琼脂糖电泳[9]。凝胶成像图像分析系统采集图像。

　　1.6 统计分析

　　采用SPSS 12.0 统计软件进行统计分析。各组间均数比较用方差分析, 以P<0.05 为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 电镜观察

　　2.1.1 透射电镜下观察

　　对照组Bel7402 细胞核较大，线粒体丰富，膜相结构完整(图1a);Fas和AD 组凋亡细胞体积变小，胞质浓缩,胞浆内空泡增多，染色质固缩、边集或碎裂成不规则块状，线粒体肿胀，核膜完整，出现凋亡小体(图1b)。AcIEFDcho组可见细胞膜相结构完整，染色质边缘聚集，线粒体肿胀(图1c)。

　　2.2 Fas和AD激活caspase8

　　2.2.1 Westernblot 结果显示

　　对照组caspase8酶原表达量很少，几乎无43/41 kD断裂片断，27 kD片断表达较弱;Fas抗体组caspase8酶表达并发生轻微断裂; Fas/AD组，激活caspase8酶原表达并断裂，形成43/41 kD、27 kD片断;FA/AD+ AcIEFDcho组caspase8酶原的表达较少，断裂片断较弱，见图2(a)。

　　2.2.2 RTPCR 结果显示

　　Fas/AD组中 caspase8 mRNA表达增加，然而与Fas/AD组相比，FA/AD+ AcIEFDcho组caspase8 mRNA表达减少，见图2(b)。

　　2.3 caspase8调节Bcl2的表达

　　Westernblot 结果显示(图3)：对照组、Fas组、FasAD组及抑制剂AcIEFDcho组细胞的Bcl2蛋白灰度值比较，Fas/AD组Bcl2表达较少与其他组比较有差异(P<0.01); 与FasAD组相比，Fas/AD组+AcIEFDcho组Bcl2的表达图1 FA/AD及抑制剂 AcIEFDcho对Bel7402细胞形态的影响较多。

　　3 讨论

　　细胞凋亡已成为一种维持机体自身稳定所必须的生理性细胞死亡，机体内细胞在凋亡过程中，严格受到基因调控，细胞恶性转化或癌细胞的产生均是由细胞增殖与细胞死亡调控功能失调所致。参与调节细胞凋亡的许多信号途径中，Fas/ FasL 是最重要的介导细胞凋亡的系统[10]。本课题组前期的流式细胞仪结果[10]与本研究电镜下的细胞超微结构变化表明，FA/AD可以明显诱导Bel7402细胞凋亡, 而caspase8的抑制剂AcIEFDcho却能抑制FA/AD诱导的凋亡。

　　通过Fas抗体刺激Fas受体导致DISC(FADD和caspase8被称为DISC)的形成、DISC添补、激活caspase8。caspase8一旦被激活，以非依赖线粒体或独立的模式激活caspase3, 通过剪切相应的底物，促使细胞发生凋亡 [1112]。本研究的Western blot与RTPCR结果显示FA/ AD诱导Bel7402细胞凋亡是通过激活caspase8来实现的, 而caspase8的抑制剂AcIEFDcho却能抑制caspase8的表达。

　　Bcl2家族作为caspase家族的作用对象而日益受到关注，尤其是，Bcl2家族蛋白在调节线粒体凋亡途径中起到一个中心作用[1314]。Bcl2家族蛋白的成员可以被分为两个亚家族成员：一个是抗凋亡蛋白如Bcl2 和 BclXL;另一个是促凋亡蛋白Bax, Bad和Bid。在凋亡中，Bcl2 或BclXL的过度表达，能保护抵抗化学疗法诱导的线粒体的细胞色素C的释放，caspase的激活和DNA断裂[15]。Bcl2 是研究最早的抑制凋亡的基因, 可以阻断细胞程序化死亡的公共信号传导通路 [16]，但其作用机制还不清楚。本研究的Western blot结果显示，对照组、Fas组、FA/AD组及抑制剂AcIEFDcho组细胞的Bcl2蛋白灰度值比较，FA/AD组与其他组比较有差异(P<0.01)。这些结果表明FA/AD诱导Bel7402细胞凋亡是通过降低Bcl2表达来实现的, Bcl2作为重要的抗凋亡蛋白，可以稳定线粒体的跨膜电位，减少膜的通透性，抑制细胞色素C释放到线粒体外，阻断有细胞色素C释放激活caspase通路，抑制caspase9对caspase3的激活作用，从而抑制凋亡，Bcl2表达的减少，促进了细胞凋亡的发生，因而体现FA/AD诱导Bel7402细胞凋亡。

　　此外，我们的数据显示caspase8与Bcl2的表达具有某些偶联的关系：在FA/AD的作用时，caspase8表达增加，细胞的凋亡增加，而Bcl2表达却减少;而当加入caspase8的抑制剂AcIEFDcho后，caspase8表达减少，细胞的凋亡减少，而Bcl2表达却增加。这表明caspase8的抑制剂AcIEFDcho能调节下游Bcl2的表达, 即激活的caspase8参与了对Bcl2的调节。FA/AD诱导的凋亡可能部分通过caspase8参与对线粒体途径的调节而实现。

　　综上所述，FA/AD可以明显诱导Bel7402细胞凋亡，激活caspase8，降低Bcl2表达;此外，在Fas和放线菌素 D诱导Bel7402细胞的凋亡过程中，激活的caspase8能调节Bcl2表达。因而Caspase8是FA/AD诱导细胞凋亡的关键点，随着对细胞生长调控机制的不断研究，明确FA/AD及其下游的信号传导通路，对抑制肿瘤细胞增殖及转移具有重要意义，为预防和治疗肝癌等疾病提供新的思路。

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