空间诱变育成的茄子“HANGQIE5”的RAPD体系优化及RAPD分析

　　【摘要】 目的 对空间诱变育成的“航茄”5号(HQ5)进行RAPD分析,寻找特异扩增条带，试图为空间诱变育种提供分子生物学证据。方法 “天水长茄” (TSCQ)和“龙果圆茄”(LGYQ)种子分别搭载“神舟”4号和“神舟”3号飞船进行空间诱变后，通过4代地面自交选育得到“天水长茄诱变第4代(TSCQMUT4)”和“龙果圆茄诱变第4代(LGYQMUT4)”2个突变系;利用后两者分别作为父母本进行杂交得到HQ5。采用正交设计对其RAPD体系进行优化并进行RAPD分析。结果 采用25 μL扩增体系(DNA: 40 ng，dNTPs:7.5 nmol，primer: 10 ng和rTaq聚合酶: 1.25 U)进行RAPD反应，发现“TSCQMUT4”与野生型TSCQ相比产生4条差异带，LGYQMUT4与野生型LGYQ相比产生1差异带;HQ5与父母本相比均有6条差异带，有父母本共有带和特有带,并且保持航天诱变产生的变异带。结论 空间诱变可能引起植物DNA水平的变异，有助于选育出新的农作物品种(系)。

　　【关键词】 空间诱变;RAPD;优化;茄子

　　Optimization of RAPD Reaction System and Analysis of “HANGQIE5” Eggplant Generated by Space Mutagenesis.REN Chunxiao, LIU Min, LU Jinying, WU Yuhuan.Space Medicine & Medical Engineering,2010,23(1):52～56

　　Abstract: Objective To analyze the new breeding of eggplant “HANGQIE5” (HQ5) generated by space mutagenesis with RAPD, identify the differential RAPD bands, and try to provide molecular proofs for space mutation breeding. Methods Dry seeds of two eggplants “Tianshuichangqie (TSCQ)” and Longguoyuanqie (LGYQ) were carried by “shenzhou4” and “shenzhou3”spaceship. Two mutant lines “TSCQMUT4” and “LGYQMUT4” were selected after four generations of selfcross of TSCQ and LGYQ. A new variety of “HQ5” was selected by crossing the two lines of “TSCQMUT4” and “LGYQMUT4”, which were male and female, respectively. The RAPD reaction system was optimized with orthogonal design and further RAPD analysis was applied. Results The RAPD reaction system was determined as follows: DNA: 40 ng, dNTPs: 7.5 nmol, primer: 10 ng, and rTaq polymerase: 1.25 U. The RAPD results displayed that TSCQMUT4 produced four differential bands compared with its wild type, while LGYQMUT4 produced one, through space flight. Six differential fragments were amplified between HQ5 and the paternal/maternal. HQ5 not only shared the common fragments with its parents, but also held some particular ones, which were stably inherited. Conclusion The results indicate that space mutagenesis could cause mutations in DNA of plants, and is helpful to generate a new breeding.

　　Key words: space mutagenesis; RAPD;optimization; eggplant

　　Address reprint requests to:LIU Min.Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101,China

　　植物空间诱变指利用返回式航天器或高空气球所能达到的空间环境(宇宙射线、微重力、高真空、弱地磁等因素)对植物(种子等)的诱变作用以产生有益变异,在地面选育新种质、新材料、培育新品种的作物育种新技术，属于物理诱变的范畴，是航天技术，生物技术和农业育种技术相结合的一种新的跨学科育种技术[1] 。空间诱变具有变异频率高、变异幅度大、多数性状的变异能够遗传等特点,某些变异是地面上用其它诱变因素处理难以得到的,因此空间诱变育种技术受到了国内外遗传育种领域的广泛重视[2]。

　　Wang等[3] 研究了空间诱变茄子种子对其SP1的生物学特性和SOD活性的影响，发现空间诱变能够明显影响茄子的生育进程，变异株体内SOD活性增加一倍多;Wang等[4]验证了空间诱变的矮杆水稻对赤霉素的敏感性并初步进行了遗传学分析。此类研究多集中基于诱变产生的新性状进行生理生化和性状的研究[5]，不能阐明诱变所涉及的遗传基础;而生物的遗传信息存在于DNA的碱基序列中，因此只有通过对物种进行分子水平的验证，才能更有力地证明空间诱变所产生的变异。分子标记技术则可以较好地弥补上述不足。RAPD(random amplified polymorphic DNA)是Wiliams等[6]提出的一种检测DNA多态性的新型分子标记技术, 操作简单，成本低且检测快速，灵敏度高，研究人员用此方法检测鉴定了多个诱变新品种[79] 。

　　本研究以甘肃省天水市地方品种“天水长茄(TSCQ)”和“龙果圆茄(LGYQ)”种子为材料,分别经“神舟”4、3号飞船搭载空间诱变,对突变体在地面进行4代系谱选育,获得2个突变系,而且2个突变系杂交育成了新品种“航茄”5号(HQ5)。对“航茄”5号，“航茄”5号父母本以及野生型进行了RAPD分析，揭示了“航茄”5号在DNA水平上的变异，为研究空间诱变育种机理提供了一些参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料及其处理

　　利用甘肃省天水市地方品种“天水长茄”和“龙果圆茄”分别搭载“神舟”4号和“神舟”3号飞船进行空间诱变处理后，进行4代地面自交选育得到“ TSCQMUT4”和“LGYQMUT4”2个自交品系，利用“TSCQMUT4”为父本，“LGYQMUT4”为母本进行杂交得到“航茄”5号杂交一代。

　　将种子包在纱袋中，在70 ℃热水中浸泡1 min，然后加冷水降温至50 ℃，搅拌至35 ℃;之后用0.1%高锰酸钾浸泡15 min，并用自来水冲洗干净。在35 ℃温箱放置2 d后，调温度至25 ℃，每天并用清水洗涤一次。待种子发芽后，将其播种于盛有营养土的花盆里;待叶子长到6～8片时，取完整，无病虫害的叶片，用锡箔纸包好在液氮速冻，保存于-80 ℃冰箱。

　　1.2 DNA提取

　　航天医学与医学工程 第23卷第1期 任春晓，等.空间诱变育成的茄子“HANGQIE5”的RAPD体系优化及RAPD分析采用CTAB法提取叶片DNA，具体参见Murray的方法[10]。

　　1.3 RAPD反应体系的优化

　　RAPD反应体系采用25 μL，选择引物S20(表2)对体系进行优化。针对反应体系中的4个组分：模板DNA(20 ng/μL)，dNTPs(2.5 mmol/L)，Primer(10 ng/μL)和Taq聚合酶(5 U/μL)的浓度，采用了L16(4 4)的正交试验优化实验组合。PCR扩增在TGRADIENT WhatmanBiometra PCR仪上进行，热循环程序为94 ℃预变性5 min 1次;之后94 ℃变性1 min，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环44次，最后72 ℃延伸10 min。反应体系中10×buffer(含20 mmol/L Mg+)为2.5 μL,其余各组分正交设计方案见表1,(1)(2)(3)(4)代表不同的处理水平。

　　1.3 退火温度的优化

　　在正交设计的基础上对热循环中的退火温度进行优化，对处理较好的组合选择4个退火温度进行比较，其它反应条件不变。

　　1.4 RAPD分析

　　采用优化的RAPD反应体系和程序，对“航茄”5号，“航茄”5号父母本以及野生型的基因组DNA进行扩增，所用40个引物如表2所示。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳上分离(110 V，100 mA)，用Golden view染色，在凝胶成像系统下扫描成像。表1 L16(4 4)正交设计因素和水平的处理组合(μL)

　　2 结果与分析

　　2.1 DNA的提取

　　DNA提取结果如图1所示，基因组的DNA分子量大约在23 kb，适合于进行RAPD扩增;提取过程中没有消化RNA，但不会影响RAPD扩增。

　　2.2 RAPD反应体系的优化

　　RAPD反应条件主要包括反应体系和反应程序。反应体系中的任何成分变化都有可能影响扩增效果[11]，因此对RAPD反应体系的主要成分：模板DNA，dNTPs，Primer和Taq聚合酶进行了正交优化，各处理组合经RAPD反应后结果如图2。处理14的条带最为清晰，多态性好;同时处理10，11，12，13的结果也较好。

　　同时利用Tanon GIS凝胶处理系统对正交结果进行了PCR分析，将处理14的指标数值定义为10，分析结果见表3[12] 。T代表某因素某水平在该列的各处理对应的指标数值总和;X代表T对应的平均值;R代表各列的极差。

　　R值大小反应了该因素对实验结果影响的大小，从分析结果可见，4个因素中对RAPD结果影响大小依次为dNTPs浓度，DNA浓度，Taq酶浓度和Primer浓度。结合图2，处理10～14扩增效果好，其主要因素dNTPs的水平都在3或4;处理1，2，3，4，6，7 dNTPs的水平都在1或2，扩增效果差;处理5和9没有扩增出条带;而处理15，16可能是由于Taq酶浓度较低导致条带模糊。根据分析结果可以得到的最佳组合为dNTPs，Primer，Taq酶和DNA的浓度水平分为在3，2，1，4，此组合与处理14相比只有Taq酶水平不同。经实验验证比较，处理14扩增效果可以满足实验要求，基于减少Taq酶用量，后续实验采用处理14组合进行RAPD扩增，即25 μL反应体系中，DNA: 40 ng，dNTPs:7.5 nmol，Primer: 10 ng和rTaq聚合酶:1.25 U。

　　2.3 退火温度的选择

　　热循环也是RAPD反应的关键环节，尤其是退火温度更为关键[13]。本实验选用引物S10和S11，对35 ℃，36 ℃，37 ℃和38 ℃4个退火温度进行比较，2次重复。结果见图3。从图中可以看出，4个退火温度扩增的带型基本一致，35 ℃扩增的效果稍差一些;36 ℃，37 ℃和38 ℃3个温度效果差别不大，为了保证扩增效率，又能达到一定的特异性，后续实验采用了37 ℃的退火温度，因此热循环程序为：94 ℃预变性5 min 1次;之后94 ℃变性1 min，37 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循环44次，最后72 ℃延伸10 min。

　　2.4 RAPD分析结果

　　由于不同物种RAPD扩增重复性不同[14]，本实验重复3次。其中引物S9，S16和S26未扩增出条带，有37个引物扩增出条带，一共扩增出122条带，平均每个引物扩增的条带数为3.3条。其中31个引物扩增的条带无差异，引物S6，S8，S23，S30 ，S32和S36扩增出差异带，且重复性好。琼脂糖凝胶电泳检测显示，“航茄”5号父本与其野生型相比产生4条差异条带，“航茄”5号母本与野生型相比缺失1条带;“航茄”5号与父本相比产生6条差异带，与母本相比也产生6条差异带。说明了天水长茄和龙果圆茄经空间诱变后发生了DNA水平上的差异。部分引物的扩增结果如下：

　　如图4所示，天水长茄与TSCQMUT4相比产生了1条差异条带(b)，大小约为700 bp，表明 图3 不同退火温度RAPD扩增结果

　　Fig.3 The results of RAPD at different annealing temperatures

　　S10, S11: primers 10 and 11; 3538: different annealing temperatures(HQ5 DNA was used as the template)

　　图4 部分引物扩增的电泳结果

　　Fig.4 RAPD patterns amplified with different primers

　　1: TSCQ (the wild type); 2: TSCQMUT4 (the paternal); 3: LGYQ (the wild type); 4: LGYQMUT4 (the maternal); 5: HQ5; M: Marker D2000(A～D:PrimersS6, S23, S30 and S36)

　　经空间搭载诱变后，天水长茄在基因组水平上可能发生了碱基的缺失，突变或插入;龙果圆茄经空间诱变后也产生了一条约1 100 bp的缺失条带(图未显示)。“航茄”5号既有父母本共有带，也有父母本特有带(c，d)，并且缺失了一条父母本共有带(a)，大小约为1 200 bp，说明可能由于空间诱变或杂交过程导致了基因组信息的变化。

　　3 讨论

　　本研究提取了茄子的基因组DNA，发现未消化的RNA对RAPD扩增结果没有明显影响，可能因为RAPD扩增过程中DNA产物成指数增长，RNA不参与扩增反应，相对含量可以忽略。传统优化PCR反应体系时多采用单个因素逐个优化，不仅繁琐，而且忽略了各因素间的相互影响。而利用正交设计则不仅可以快速、科学地优化RAPD反应体系，而且能较好考虑各个因素的相互作用及综合效果。

　　对RAPD结果进行统计，平均每个引物扩增出3.3条带，而用同样的引物对辣椒基因组DNA进行RAPD扩增，平均每个引物扩增的带数为5.9条[8]，表明茄子基因组DNA的多态性可能较低[15]。本研究育成的“航茄”5号在DNA水平上和其父母本有明显的差异，可以认为“航茄”5号是空间诱变产生的一个新品种。可见，空间诱变育种作为一种新型的育种技术, 可以从DNA水平上对植物进行诱变选育;并且由于它的变异频率高，变异幅度广，采用田间观察和分子标记相结合的方法可以缩短育种周期的特点[1, 7] ，空间诱变育种和传统育种方法相结合将是一种有效的育种新技术。

　　RAPD技术是一种简单，快速，省力，节约的分子标记方法[16]，通过RAPD分子标记方法，揭示了植物材料DNA水平上的变异，可以直接反映出空间条件对植物遗传性的影响，在很多研究中都得到了应用。然而RAPD技术也有局限性，不能有效鉴别杂交子，易受反应条件影响等[17]。此外，植物在传代筛选过程中也可能发生自发突变，因此将来应用RAPD检测突变的研究应该在RAPD结果的基础上，结合诱变率、回复率、辐射强度等因素，加深对植物诱变产生的分子机理的认识。

　　本实验可为进一步研究空间诱变的机理，进行空间诱变育种提供一些分子生物学证据。

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