琐琐葡萄提取物多糖、黄酮对肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用

　　作者：张琳　马龙， 刘涛， 苏德奇， 俞丹， 赵晨 作者单位：新疆医科大学公共卫生学院毒理学教研室， 新疆乌鲁木齐830011

　　【关键词】 琐琐葡萄 提取物 多糖 黄酮 肝癌细胞HepG2 增殖抑制作用

　　Study on the inhibiting capacity of flavonoid and polysaccharide extracted

　　from SuoSuo Grape to HepG2 Cells′ reproductive activity

　　ZHANG Lin, MA Long, LIU Tao, et al

　　(Department of Toxicology, College of Public Health, Xinjiang Medical University,

　　Urumqi 830011, China)

　　Abstract: Objective: To observe the inhibiting effect on flavonoid (VTF) and polysaccharide (VTP) extracted from SuoSuo Grape to HepG2 Cells′ reproductive activity by MTT method in vitro. Methods: HepG2 cells were cultured in vitro and interfered by different concentrations of VTF and VTP for 24, 48, 72 hours respectively. The inhibition of VTF and VTP extracted from SuoSuo Grape to HepG2 cells were detected by MTT Method. Results: (1) The HepG2 cells kept proliferating in 24 hours in all groups. (2) The VTF and VTP extracted from SuoSuo Grape show the inhibition to HepG2 cells compared with the negative control group at 48h and 72 h (P<0.05), except 72 h VTP (12 500 mg/L). (3) Repeated analysis proved that VTP and VTF extracted from SuoSuo Grape have an inhibiting effect on the proliferation of HepG2 cells. At the same time an interaction effect between time and dose can be observed. Conclusion: The results proved the inhibition of VTP and VTF. VTF and VTP extracted from SuoSuo Grape show the best inhibiting effect on the proliferation of HepG2 cells at 48 h.

　　Key words: SuoSuo Grape; flavonoid and polysaccharide; HepG2 cells; MTT

　　琐琐葡萄(Vitis viniferal L.)为葡萄科葡萄属落叶藤本植物葡萄的成熟果实, 既是居民喜爱并长期食用的果品， 又被维吾尔医学用作滋补强壮、软坚驱寒、补肝利胆的药物[1]， 同时， 又是传统医学常用补气药[2]。古书记载葡萄具有主筋骨、利湿痹、健脾胃、滋肾液、益阴肝、止渴等作用，民间用于治疗小儿麻疹和肝炎等症[3]。目前有文献报道，植物体外抗肝癌细胞生长活性成分研究，归纳总结出具有抗肝癌作用的植物源天然产物包括多糖，黄酮，萜类，酚类等化合物[4]。利用HepG2细胞株筛选中草药抗肝癌活性的实验研究发现，植物中的三萜，黄酮和多糖类化合物可显著抑制癌细胞增殖及对癌细胞凋亡起到一定作用。本实验中选用的琐琐葡萄提取物多糖(VTP)和黄酮(VTF)在前期研究中显示出在体内外皆有一定的抗HBV作用和对免疫性肝损伤的保护作用，但这些成分是否具有抑制肝癌细胞增殖作用尚不清楚。本研究选用单位质量活性成分含量较高的且维吾尔医药用葡萄—琐琐葡萄作为研究对象，利用HepG2细胞株在体外筛选琐琐葡萄抗肝癌的潜在目标化合物，并采用重复测量方差分析，判断VTP，VTF在体外抑制肝癌细胞株HepG2的作用及效果，为进一步研究其抗癌机制提供最初实验依据和线索。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1细胞肝癌HepG2细胞株，该细胞分泌多种血浆蛋白：清蛋白、α2巨球蛋白、血纤维蛋白溶酶原、铁传递蛋白等。能大容量培养，乙肝表面抗原阴性，对G418有抗性，对人生长激素有刺激反应(新疆医科大学营养与食品卫生学教研室) 。

　　1.1.2试剂DMEM培养基( GIBCO公司);胎牛血清(杭州四季青生物制品公司);青霉素链霉素(哈药六厂);MTT和二甲基亚飒(DMSO)(Sigma公司);L谷氨酰胺(Amresco公司);0.025%胰蛋白酶(Amresco公司)。

　　1.1.3药物阳性对照5氟尿嘧啶(5FU) 购自上海旭东海普药业有限公司，批号H31020593);琐琐葡萄多糖(VTP)及琐琐葡萄总黄酮(VTF)由本课题组提取分离。其中VTP和5FU用无血清DMEM溶解，VTF用DMSO助溶，加一定量培养液稀释，用0.2微米孔径微孔滤膜滤过除菌，备用。

　　1.1.4仪器CO2培养箱(HEAL FORCE公司HF212 UV);离心机(上海安亭 TDL40B);自动酶标仪 (MK3 型酶标仪) ;倒置显微镜 (MOTIC公司 101M );高压锅;水浴震荡器;烘箱;分析天平; 96孔细胞培养板 (Corning公司)。

　　1.2方法

　　1.2.1实验设计采用成组设计，分别研究不同浓度琐琐葡萄提取物VTP(50 000、25 000、12 500、6 250、3 125、1 562.5、781.25、390.63、195.31、97.66 μg/ml)和VTF(8.00、 4.00、2.00、1.00、0.50、0.25 μg/ml)及阳性对照药物5FU(0.19、0.38、0.76、1.53、3.05μg/ml)对HepG2细胞在加药后24、48和72 h的抑制作用。

　　1.2.2样品溶液的配置精密称取VTP 5 g，用50 ml DMEM溶解，用磁力搅拌器低速搅拌30 min，配制成100 mg/ml的贮备液;精密称取VTF 0.1 g，用1 ml DMSO溶解，配制成100 mg/ml贮备液。再根据需要分别以1∶1的比例配制混合样品贮备液。取1只5FU注射剂，用不加血清DMEM经过倍比稀释得到需要浓度的贮备液。以上各贮备液放置4℃保存备用。细胞MTT毒性试验临用前，分别吸取各贮备液，用DMEM培养基倍比稀释至使用浓度。每个样品复3孔上样。

　　1.2.3细胞培养将HepG2细胞接种于25 cm2细胞培养瓶中，加入高糖DMEM培养基(每100 ml含10%灭活胎牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml, L谷氨酰胺1 ml, HEPES 2 ml)，用 50 mg/L NaHCO3调 pH 7.2～7.4，37℃，5%CO2培养箱中培养，每2天换液一次，3～4天传代[5]，本次实验选用第五代细胞。

　　1.2.4MTT试验实验设阴性对照组，空白组，阳性对照组和不同浓度药物组，采用MTT法测定细胞抑制率[6]。收集对数期细胞，用0.025%的胰蛋白酶消化，采用白细胞计数板计数，并用培养基稀释为7×104个/ml，分别加入96孔细胞培养板中，每孔加入100 μl，铺板使待测细胞调密度至7 000个/孔，置5%CO2，37℃孵育。接种24 h，镜下观察到细胞单层铺满孔底，弃去培养基，分别加入用DMEM培养基稀释的不同浓度样品，每孔100 μl，每个浓度3个复孔，同时每板设8个空白孔和6个阴性对照孔，置5%CO2，37℃孵育24、48和72 h。至各时间点时，在细胞培养孔中加入5 mg/ml的MTT溶液，每孔40 μl，置37℃继续孵育4 h后，加入DMSO，每孔150 μl，混匀，用振荡器振荡，使甲臜完全溶解，用酶标仪在492 nm波长下比色，测定各孔的吸光度OD值[7]。以相同条件，无药物细胞对照组作为对照，按以下公式计算细胞抑制率，以样品浓度为横坐标，生长抑制率为纵坐标绘制出浓度–抑制率曲线，并按照多组方差分析LSD检验和重复测量方差分析对各组吸光度值进行综合分析。抑制率(%)=(1-OD给药组/OD细胞对照组)×100%[8] 式中给药组为给予不同浓度的药物实验组，细胞对照组为不加药物处理的细胞对照组。

　　1.3统计学处理使用SPSS16.0统计分析软件，实验数据以(±s)表示，各实验组的吸光度同阴性对照组相比采用LSD两两比较;不同时间各组剂量比较采用重复测量方差分析。若组间方差不齐则采用非参数秩和检验，检验水准α=0.05。

　　2结果

　　2.1琐琐葡萄提取物黄酮、多糖作用24、48和72 h后对HepG2细胞增殖的抑制率在24 h各试验组对HepG2细胞增殖无抑制作用，但随着受试物作用时间增长，除72 h VTP剂量组12 500 mg/L外，在48 h和72 h VTP、VTF对HepG2细胞增殖均表现出抑制作用，与阴性对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05～0.01)(表1)。表1琐琐葡萄提取物黄酮、多糖作用24 h、48 h、72 h后对HepG2细胞增殖的抑制率

　　2.2琐琐葡萄提取物黄酮、多糖作用24、48和72 h的重复测量方差分析结果

　　2.2.1球形检验和分组主效应方差分析结果本实验采用VTP、VTF各剂量组不同时点对HepG2细胞抑制率的研究，符合重复测量的实验设计，故选用重复测量方差分析，旨在阐明分组因素和时间因素分别对肝癌细胞抑制率的作用和两因素是否存在交互作用。从Mauchly 球形检验结果得出本实验数据满足球形假设(P>0.05)， 则不需要进行校正，即可以使用重复测量方差分析进行数据统计。进一步分析时将VTF、VTP和5FU三组药物进行比较，发现分组因素为主效应时这三组药物对肝癌细胞株HepG2细胞的抑制影响差异无统计学意义(F=1.392, P=0.274)。将VTF、VTP和阴性对照三组药物进行比较，发现分组因素为主效应时三组药物对肝癌细胞株HepG2细胞的抑制影响差异存在统计学意义(F=3.973, P=0.043);证明了琐琐葡萄提取物VTF、VTP有类似明确抗癌药物5FU的作用，对肝癌细胞株HepG2细胞的增殖有一定的抑制作用。

　　2.2.2时间因素主效应和时间因素与分组因素交互效应方差分析结果以时间因素为主效应时，不同试验药物对肝癌细胞株HepG2细胞抑制影响的差异有统计学意义(F=135.15, P<0.001);测定时点与药物剂量分组存在交互作用(F=2.809, P<0.05);试验药物对肝癌细胞株HepG2细胞的抑制影响(图1)。

　　图1时间因素与分组因素交互效应轮廓图3讨论琐琐葡萄为葡萄科葡萄属植物葡萄(Vitis viniferal L.)的成熟果实，主产于新疆吐鲁番、和田、鄯善等地，维吾尔医药用其果实，用于治疗脾胃不和、神志不安等，民间用于小儿麻疹、肝炎等症，效果显著。以往的实验研究表明葡萄可通过抗氧化和清除自由基等作用发挥保肝降酶功效，并在体内外皆有抗HBV病毒和对免疫性肝损伤的保护作用，但其是否对肝癌细胞增殖有抑制作用未见报道。多糖 (Polysaccharides) 广泛分布于多种生物体中，尤其是动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中，是一类有醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，是构成生命的分子基础之一。近年来植物多糖的研究备受各国科学家关注，也其具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎症、抗病毒、抗辐射及降血糖等多种功能，被誉为“生物反应调节剂(biological response modifier, BRM)”之称[9]。因其独特的药理活性和低毒效应，在临床应用中具有极大潜力。黄酮 (flavones) 广泛存在自然界的某些植物和浆果中，在植物体内大部分与糖结合成苷，少部分以游离形式存在，是一种很强的抗氧剂。可有效清除体内的氧自由基，这种阻止氧化的能力是维生素E的10倍以上，具有降血脂、降胆固醇、改善血液循环、保肝抗炎、阻止细胞的退化衰老以及雌激素样作用[10]。　HepG2细胞来源于一个15岁白人的肝癌组织。能大容量培养，乙肝表面抗原阴性，对G418有抗性，对人生长激素有刺激反应。该细胞表达3羟基3甲基戊二酸辅酶A还原酶和肝甘油三酸脂脂肪酶,在有百草枯 (英文名：gramoxone) 的环境下过氧化氢酶mRNA表达增加，ApoAI mRNA 表达减少[11]。本实验应用HepG2细胞株对琐琐葡萄提取物VTP和VTF进行了细胞增殖的抑制实验，统计学分析采用重复测量设计资料的方差分析，可以综合考虑到分组因素在不同时点上的关联性和随时间变化的趋势，同时避免了该类资料误用t检验和随机区组方差分析而导致的假阳性错误增大的情况。经重复测量方差分析，证明琐琐葡萄提取物VTF、VTP在48 h和72 h对HepG2细胞的增殖有一定的抑制作用，测定时点与药物剂量分组存在交互作用;VTF、VTP在48 h对肝癌细胞HepG2的抑制能力相对其他两个时点较强。在浓度抑制率曲线中，随着受试物浓度的增加，除在24 h VTP、VTF对HepG2细胞增殖未表现出抑制作用外，48和72 h VTP、VTF绝大部分剂量组与阴性对照组相比均表现出对HepG2的抑制作用，但未观察到剂量反应关系。由于3个时点镜下观察均未发现细菌等其他微生物，排除了外界感染导致实验结果偏差的可能性。推测可能与以下几个原因有关：(1) 细胞在24 h仍处于快速生长期，药物作用未发挥充分使得药物的抑制作用被忽略;(2) 对VTP、VTF药物组剂量的选取是在参照相关文献和进行预试验后得出，但是琐琐葡萄中的VTP、VTF为首次提取，可能会和其它药材中提取的同剂量VTP、VTF作用效果有一定偏差而导致剂量反应关系不明显。(3) MTT比色法检测的细胞抑制率包括细胞死亡和细胞增殖抑制两个方而，而细胞的死亡又包括许多凋亡细胞和极少数坏死细胞。凋亡是受基因调控、细胞主动参与且自身有一定程序的生理性死亡过程，又称程序性细胞死亡或细胞自杀。因此，选用一个最佳浓度，既能抑制细胞增殖，同时又对细胞毒性较小的浓度甚为重要。可能在一定实验药物浓度下，细胞凋亡机制被抑制导致药物对HepG2细胞抑制率下降甚至出现相反作用。在时间–抑制率曲线中，除VTP 50 000 mg/L在72 h达到峰值，其余VTP和VTF剂量组的抑制率与阴性对照组相比较均在48 h达到峰值。综上所述，琐琐葡萄对肝癌细胞株HepG2的增殖有一定抑制作用，其发挥作用的物质基础包含VTP和VTF，相对于24 h和72 h，48 h为其发挥抑癌效应的最佳时间。这些活性成分发挥作用的机制还有待进一步深入的研究。

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