BK8644对河豚毒素引起的大鼠海马锥体神经元AMPA受体介导的微小兴奋性突触后电流频率和幅度的影响

　　【摘要】 目的 观察L型钙通道(LTC)开通剂BK8644对河豚毒素(TTX)引起的大鼠海马锥体神经元α氨基羟基5甲基 4异唑丙酸(AMPA)受体介导的微小兴奋性突触后电流(mEPSCAMPA)的影响，探讨LTC是否作为神经环路兴奋性的感受器在调节突触稳态中发挥作用。方法 建立培养海马神经元的稳态可塑性离体模型，并采用膜片钳全细胞模式记录突触内自发的mEPSC。结果 TTX组mEPSCAMPA的频率显著高于对照组(P<0.05)，而mEPSCAMPA电流幅度无显著差异(P>0.05);BK8644组和TTX+BK8644组与对照组比较，mEPSCAMPA的频率和幅度均无显著差异(P>0.05);TTX+BK8644组与TTX组比较，mEPSCAMPA频率降低(P<0.05)，电流幅度无显著差异(P>0.05)。结论 BK8644可对抗TTX引起的mEPSCAMPA 频率升高，提示L型钙通道可能参与稳态突触可塑性的调节。

　　【关键词】 L型钙通道 海马神经元 膜片钳记录 微小兴奋性突触后电流

　　Effect of BK8644 on frequency and amplitude of mEPSCAMPA induced by tetraodontoxin in cultured hippocampal pyramidal neurons of rats

　　JIE Yanling,LI Shuji,XING Yanli,et al

　　Department of Neurobiology, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China

　　Abstract: Objective To examine the effects of the Ltype calcium channel agonist BK8644 on the mEPSCAMPA induced by tetraodontoxin(TTX) in cultured hippocampal pyramidal neurons of rats,and to explore the roles of Ltype calcium channel in the regulation of homeostatic synaptic plasticity.Methods The model of homeostatic synaptic plasticity of cultured hippocampal pyramidal neurons was established, and the synaptic mEPSC was recorded by Wholecell patchclamp recordings.Results The frequence of mEPSCAMPA was higher in TTX group than this in control group(P<0.05),but there was no significant difference in the amplitude of mEPSCAMPA between two groups(P>0.05).There was no significant difference in the frequence and amplitude of mEPSCAMPA among BK8644 group, TTX+BK8644 group and control group(P>0.05). The frequence of mEPSCAMPA was lower in TTX+BK8644 group than that in TTX group(P<0.05),but there was no significant difference in the amplitude of mEPSCAMPA between two groups(P>0.05).Conclusion BK8644 can prevent the increase of the frequence of mEPSCAMPA induced by TTX, it suggest that the Ltype calcium channel may be involved in the regulation of homeostatic synaptic plasticity.

　　Key words: Ltype calcium channel; hippocampal neuron; patchclamp recording;miniature excitatory postsynaptic current

　　突触可塑性可分为Hebbian 可塑性和突触稳态可塑性。Hebbian 可塑性包括长时程增强(longterm potentiation,LTP)和长时程抑制(longterm depress,LTD)。仅用Hebbian 可塑性理论解释突触传递会出现传递的信号完全消失或者达到饱和的问题，使信号失真[12]。但是神经元并未出现这样的情况，因为突触自身具有使突触效能保持在一定范围的能力，这种能力被称为突触稳态可塑性。在培养基中加入河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)或bicuculline抑制或增强神经元的电活动，1～2 d后神经元的突触活动会出现相反方向的变化，这就是研究突触稳态可塑性的离体模型。近年研究表明，Arc/Arg3.1介导的α氨基羟基5甲基4异唑丙酸(αamino3hydroxy5methyl4isoxazoleppropionate,AMPA)受体前后膜是突触稳态可塑性发生的重要机制[35]。但目前对感受神经环路兴奋性的感受器仍不清楚。L型钙通道(Ltype calcium channel,LTC)是电压门控型钙通道之一，主要表达在中枢神经元的胞体和树突上[6]。LTC可将神经元的电活动变化耦联到细胞内的信号通路和基因表达调控[78]。因此，本研究探讨LTC是否作为神经环路兴奋性的感受器在调节突触稳态中发挥作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　清洁级SD乳鼠，1日龄，雌雄不拘，由南方医科大学实验动物中心提供。

　　1.2 主要试剂及仪器

　　达尔伯克(氏)必需基本培养基(dulbecco′s minimum essential medium，DMEM/F12)、neurobasal(Gibico);胎牛血清(杭州四季青公司);乙二醇双(2氨基乙醚)四乙酸[ethyleneglycol bis(2aminoethyl ether)tetraacetic acid,EGTA](上海生工);多聚赖氨酸，阿糖胞苷，胰蛋白酶，羟乙基哌嗪乙磺酸(hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid,HEPES)，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)，河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)，BK8644，bicuculline，2氨基5磷酸基戊酸(2amid5phosphatebutylcarboxylic acid,APV)，6氰基7氨磺酰苯喹喔啉2，3二酮(6cyano7nitroquinoxaline2,3dione,CNQX)，DGluconic acid monopotassium salt均为Sigma公司产品;其他试剂为国产分析纯。微电极拉制仪(P97，美国Sutter Instrument);微电极操纵器(MP285，美国Sutter Instrument);红外微差干涉对比显微镜(NIKON);MultiClamp700B膜片钳放大器(Axon Instruments);DIGITA1322实验数据采集系统(Axon Instruments);PClamp10软件(Axon Instruments)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 大鼠海马神经元的分离、培养

　　1日龄的SD乳鼠乙醚深度麻醉后断头处死，取出脑组织，分离海马，将海马剪碎，经2.5 g·L-1胰蛋白酶作用5 min，完全培养基终止消化，用吸管吹散细胞。将细胞悬液经400目尼龙网过滤，900 r·min-1离心7 min，加neurobasal培养基(含2%B27)重悬，调细胞密度为1×105·mL-1，然后将细胞悬液加入事先包被多聚赖氨酸的培养板中，置于CO2培养箱内培养。以后每3 d换液1次，第3天加入5 μmol·L-1阿糖胞苷。培养液成分：136 mmol·L-1 NaCl，2.5 mmol·L-1 KCl，10 mmol·L-1 HEPES，10 mmol·L-1 Dglucose，2 mmol·L-1 CaCl2，1.3 mmol·L-1 MgCl2，0.01 mmol·L-1 bicuculline，0.05 mmol·L-1 APV，pH 7.4，调节渗透压为320 mOsm。

　　1.3.2 分组及处理

　　培养8 d以后，根据分组，培养液中分别加入相应试剂：对照组不加药物;TTX组加入1 μmol·L-1 TTX;BK8644 组加入0.5 μmol·L-1 BK8644;TTX+BK8644组加入1 μmol·L-1 TTX和0.5 μmol·L-1 BK8644。各组细胞加药后孵育48 h。每组完整记录10个神经元。

　　1.3.3 膜片钳记录

　　各组细胞加药孵育48 h后即可用于做膜片钳实验。所有实验均在室温下进行。培养海马神经元有功能突触的形成始于培养5 d后，8 d后就有相当多的突触已经形成。膜片钳记录选择健康典型的海马锥体细胞，胞体呈锥体，有1根粗大的顶树突，细胞膜光亮完整，没有颗粒，跟周围的神经元有突触联系[910]。全细胞模式记录自发的微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynaptic current,mEPSC)。钳制电位为-60 mV，电极入水电阻4～6 MΩ。电极内液成分：130 mmol·L-1 potassium gluconate，10 mmol·L-1 NaCl，1 mmol·L-1 EGTA，0.133 mmol·L-1 CaCl2，2 mmol·L-1 MgCl2，10 mmol·L-1 HEPES，3.5 mmol·L-1 MgATP，1 mmol·L-1 NaGTP，pH 7.4，调节渗透压为300～310 mOsm，-20 ℃保存。

　　在整个实验过程中串联电阻为20～30 MΩ。若实验中输入电阻或串联电阻变化超过20%，则弃去该细胞。每个神经元记录到的事件数应≥20，用软件Minianalysis 6.0进行分析。

　　1.3.4 AMPA受体介导的微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynaptic curren,mEPSCAMPA)的鉴定

　　为了记录mEPSCAMPA，在浴槽液中加入APV和bicuculline，分别阻断N甲基D门冬氨酸(nmethylDaspartate,NMDA)受体和γ氨基丁酸A(γ aminobutyric acid,GABAA)受体。在上述浴槽液条件下，记录到许多自发的微小突触后电流，5 μmol·L-1 CNQX(AMPA受体特异性阻断剂)可阻断所有的微小突触后电流，证明记录到的电流是mEPSCAMPA。

　　1.4 统计学处理

　　实验数据用均数±标准差(±s)表示。使用SPSS 11.0 统计软件单向方差分析(Oneway ANOVA)对实验结果进行分析。P<0.05为有显著差异。

　　2 结果

　　TTX组mEPSCAMPA的频率显著高于对照组(P<0.05)，而mEPSCAMPA电流幅度无显著差异(P>0.05);BK8644组和TTX+BK8644组与对照组比较，mEPSCAMPA的频率和幅度均无显著差异(P>0.05);TTX+BK8644组与TTX组比较，mEPSCAMPA频率降低(P<0.05)，电流幅度无显著差异(P>0.05)。见表1。表1 各组mEPSCAMPA的频率和幅度比较(略)

　　3 讨论

　　本实验采用全细胞模式记录mEPSCAMPA，观察到TTX 抑制原代培养海马锥体神经元环路活动后mEPSCAMPA频率升高，并且，LTC开通剂BK8644可对抗TTX 的这一作用。实验结果表明BK8644本身不能引起海马锥体神经元mEPSCAMPA的变化，但是却能对抗TTX的作用。其可能的机制是：正常情况下，神经环路的基础电活动激活的LTC已足够使突触后膜AMPA受体维持在下限水平;LTC是电压敏感型的离子通道，所以当TTX使整个神经元环路活动降低时，此通道活动降低，钙离子内流减少，Arc/Arg3.1表达下降，使AMPA受体下膜减少，这就导致了突触活动的增加;而当单独加入开通剂BK8644后，由于已激活的LTC足够使AMPA受体维持在下限水平，所以更多的LTC开放不会起明显作用;而当BK8644和TTX一起使用时，就能对抗TTX的作用。

　　使用TTX培养海马神经元2 d以阻断神经元环路活动能导致兴奋性突触传递的改变，但是这种突触传递的改变有时表现为幅度的改变[1113]，有时表现为频率和幅度都有改变[910]。Wierenga等[14]研究表明，培养2周以内的神经元只有幅度变化，培养≥18 d时频率和幅度都有改变。本实验得到的结果是幅度没有改变而频率有升高，对此的合理解释应该类似于Nakayama等[15]学者的观点：(1)原来沉默的突触由于AMPA受体上膜变成了有功能的突触;(2)新突触的生成：本实验所用细胞均为8～12 d，所以有更多的潜能生成新突触。

　　本实验结果提示，LTC作为神经环路兴奋性的感受器在调节突触稳态中发挥作用，并首次提出了LTC参与突触稳态可塑性的调节。

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