单侧隐睾复位大鼠血清性激素及抗精子抗体的检测

　　【摘要】 目的 探讨单侧隐睾复位大鼠血清性激素及抗精子抗体(AsAb)的水平。方法 将21日龄SD雄性大鼠48只随机分为假手术组和单侧隐睾组各24只，2周后行隐睾大鼠睾丸下降固定术，于40日龄、60日龄采集血清后处死。采用ELISA间接法测定血清AsAb水平。用放射免疫方法测血清雌二醇(E2)、睾酮(T)水平。结果 40日龄、60日龄时2组血清E2和T水平比较均无显著差异(P>0.05);2组60日龄时的E2、T水平均较40日龄时显著增高(P<0.05)。单侧隐睾组大鼠40日龄、60日龄时血清AsAb IgG、IgA、IgM水平均显著高于假手术对照组(P<0.05);60日龄时隐睾组大鼠血清AsAb水平高于40日龄(P<0.05)，而假手术组血清AsAb水平无显著差异(P>0.05)。单侧隐睾组大鼠AsAb的检出率明显高于假手术组(P<0.01)。结论 隐睾大鼠行睾丸下降固定术后，存在高雌激素血症;AsAb产生可能是导致男性不育的原因之一。

　　【关键词】 抗精子抗体 隐睾 大鼠 雌二醇 睾酮

　　Detection of serum sex hormone levels and antisperm antibody in unilateral cryptorchidism rats after orchiopexy

　　SONG Cuiping,WANG Hailei

　　Department of Pediatric Surgery，the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College，Weihui 453100，China

　　Abstract: Objective To study the levels of serum sex hormone and antisperm antibody(AsAb) in unilateral cryptorchidism rats after orchiopexy.Methods Fortyeight SpragueDawley(SD) male rats were divided into sham operation group(n=24)and unilateral cryptorchidism group(n=24)at age of 21 days.Two weeks later，the rats with cryptorchidism were performed with orchiopexy.At age of 40 days and 60 days，blood samples were taken for analysis and rats were killed.The serum AsAb were detected by enzymelabeled immunosorbent assay,the serum estradiolum(E2) and testosterone(T) were detected by radioimmunoassay.Results At age of 40 days and 60 days,there was no significant difference in serum E2 and T between two groups(P>0.05).The serum E2 and T levels were higher at age of 60 days than these at age of 40 days in two groups(P<0.05).At age of 40 days and 60 days,The serum AsAb IgG、IgA、IgM levels were higher in unilateral cryptorchidism group than these in sham operation group(P<0.05).The serum AsAb levels were higher at age of 60 days than this at age of 40 days in unilateral cryptorchidism group(P<0.05),but there was no significant difference in sham operation group(P>0.05).The detection rate of serum AsAb was higher obviously in unilateral cryptorchidism group than this in sham operation group(P<0.01).Conclusion There were hyperestrinemia in rats with unilateral cryptorchidism after orchiopexy,AsAb may be a cause of male infertility.

　　Key words: antisperm antibody;cryptorchidism;rat;estrodiol;testosterone

　　隐睾是指睾丸未能按正常发育过程通过腹股沟管沿着腹膜鞘突下降至阴囊底部,而是停留在下降途中任何部位,也称睾丸下降不全[12]。隐睾症是男性不育的主要原因之一，单侧隐睾不育率为40%，双侧隐睾不育率高达70%[3]。隐睾导致男性不育的机制可能与抗精子抗体(antisperm antibody，AsAb)的产生有关[4]，但深入研究不多。本研究通过建立大鼠单侧隐睾模型及复位模型，检测不同日龄隐睾复位大鼠血清性激素水平及AsAb的阳性率，探讨AsAb与生精能力的关系及其产生的可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　雄性大鼠48只，郑州大学实验动物中心提供，21日龄;体质量50～65 g。随机分成假手术组和单侧隐睾组各24只。

　　1.2 主要仪器与试剂

　　SN697全自动双探头放射免疫γ计数器、奥地利Anthos 2010 酶标仪和奥地利Anthos Fluido 洗板机。雌二醇(estrodiol，E2)、睾酮(testosterone，T)放射免疫分析试剂盒购自北京北方生物技术研究所(批号：061220);羊抗大鼠抗精子抗体IgG、IgA、IgM试剂盒由美国ADL公司提供，批号：RT110371。

　　1.3 动物模型制备

　　(1)隐睾模型：参照文献[56]于SD雄性大鼠21日龄时建立，用氯胺酮(30 mg·kg-1)肌肉注射麻醉后，取下腹正中小横切口，切断右侧睾丸引带，用7 0无创伤缝合线将睾丸固定于后腹壁上;牵拉左侧睾丸引带，不切断，将睾丸缝合1针，立即还纳至阴囊，分2层关腹，制成右侧隐睾模型;假手术组其双侧睾丸的处理同隐睾模型左侧睾丸处理方法。(2)隐睾模型建立2周后，建立隐睾复位模型用氯胺酮麻醉后，取腹正中小切口，分离黏连、固定于后壁上的右侧睾丸，将其送进阴囊，并在阴囊皮肤外用7 0无创伤尼龙线将睾丸固定。假手术组其双侧睾丸已自行降入阴囊，不用2次手术。

　　1.4 检测方法

　　2组于40日龄、60日龄各抽出12只，氯胺酮麻醉测体质量后心脏穿刺抽血3 mL，血液离心后血清置-20℃冰箱内，采用酶免疫吸附试验(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA法)检测AsAb IgG、IgA、IgM水平。根据95%上界值，确定样品中AsAb IgG浓度≥4.838 ng·mL-1，判定为血清AsAb IgG阳性;血清中AsAb IgM≥1.053 ng·mL-1或IgA≥5.700 ng·mL-1被视为血清AsAb IgM或IgA阳性。AsAb IgG、IgA、IgM其中之一为阳性，则认为该病例AsAb阳性。采用放射免疫方法测得血清E2、T水平。

　　1.5 统计学处理

　　数据用SPSS 13.0软件处理，计量资料用均数±标准差(±s)表示，采用方差分析，以α=0.05为检验标准，以P<0.05表示有显著性意义。

　　2 结果

　　2.1 大鼠血清E2和T测量结果

　　40日龄、60日龄时单侧隐睾组E2水平高于假手术组,而T水平低于假手术组，但均无统计学意义(P>0.05);单侧隐睾组和假手术组60日龄时的E2、T水平均较40日龄时显著增高(P<0.05)。见表1。表1 不同日龄大鼠血清E2和T水平比较(略)

　　2.2 各组不同日龄大鼠血清AsAb IgG、IgA、IgM定量测量

　　假手术组无1例AsAb阳性。40日龄、60日龄时单侧隐睾组大鼠血清AsAb阳性率分别为65.23%、50.00%，显著高于假手术组(P<0.05)，且AsAb IgG、IgA水平显著高于假手术组(P<0.05);60日龄时单侧隐睾组大鼠血清AsAb水平高于40日龄(P<0.05)，血清AsAb阴性率无显著差异(P>0.05);40日龄和60日龄时假手术组血清AsAb水平无显著差异(P>0.05)。见表21。表2 不同日龄大鼠血清AsAb IgG、IgA、IgM水平比较(略)

　　3 讨论

　　隐睾症是小儿外科常见的泌尿生殖系统先天性畸形[78]，易引起不育症。男性性别分化是由胎儿睾丸产生的T和副中肾管抑制物质(mullerianinhibiting substance,MIS)介导的，而T必须在5α还原酶的催化下成为二氢睾酮(dihydrotesto sterone,DHT)才能发挥作用，睾丸引带、精索、阴囊在DHT的作用下分化发育而促使睾丸正常下降。因此任何T产生不足、过迟或T转化为DHT的过程出现异常及MIS缺乏或过量均可导致隐睾[9]。SD大鼠对性激素刺激敏感性高，适合进行内分泌研究[10]，自然隐睾患侧睾丸与手术复制隐睾模型改变一致[11]，故大鼠是研究隐睾症的良好动物模型。本实验选用21日龄SD大鼠制隐睾动物模型。实验过程中有3只大鼠死亡，2只睾丸下降到阴囊，模型复制成功。隐睾大鼠行睾丸下降固定术后第5天(40日龄)、第25天(60日龄)单侧隐睾组与假手术组间血清T水平差异无统计学意义。单侧隐睾组血清E2水平比假手术组较高，虽无统计学意义，但说明单侧隐睾组仍存在高雌激素血症，可能与隐睾的发生有关。

　　隐睾患者的不育率很高，导致不育的主要原因与睾丸的环境温度有关，目前研究认为和自身免疫也有一定的关系。AsAb阳性率在非选择性不育患者中的发生率为3%～15%，在有明显不育表现的患者中为35%，在生育力正常的患者中不足1%[12]。成年隐睾患者的AsAb阳性率为66%，行睾丸下降固定术者AsAb阳性率为52%[13]。本研究显示，隐睾大鼠40日龄、60日龄时AsAb阳性率分别为65.23%%、50.00%，假手术组AsAb阳性率为0.00%，单侧隐睾组AsAb阳性率显著高于假手术组，AsAb阳性率随着睾丸固定术后日龄的延长而降低，但较假手术组仍明显增高。隐睾处于相对高温的环境中，高温可导致支持细胞变性，使血睾屏障的通透性增加，精子抗原得以与血循环的免疫系统相接触，通过免疫应答产生AsAb，AsAb又可以反过来加重睾丸的损害。隐睾睾丸复位后其环境温度改变有利于睾丸的正常发育，但仍存在着不可修复的免疫机制的破坏。另外，隐睾患儿的睾丸活动性较在阴囊内减少，易受外伤，或因手术过程中挤压和白膜固定，都可造成血睾屏障的破坏，产生AsAb。本研究结果显示，单侧隐睾组AsAb阳性率比假手术组明显升高，说明除手术的影响外，隐睾所处的环境对血睾屏障的影响促进了AsAb的产生。

　　血清AsAb通常作为人类免疫不育的确定标准之一，存在于精液中的精子抗体大部分来自前列腺漏出的血清，其中IgG、IgA的水平约为血清的1%，当血清抗体滴度>132时，方可在精浆中发现IgG、IgA[14]，血清与精浆中的AsAb符合率达75.90%，表明血清AsAb检测对男性免疫性不育诊断有重要意义。本研究结果显示隐睾大鼠睾丸下降固定术后的血清AsAb阳性率和AsAb IgG、IgA、IgM水平都明显高于假手术组，且幼鼠与成鼠AsAb的阳性率无显著差别，提示在临床上隐睾患儿血清AsAb的检测对预测成年后的生育能力有一定的作用。

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