电针对神经痛大鼠治疗作用的研究

　　【摘要】 目的 观察神经痛大鼠电针治疗前后脊髓背角与痛觉相关的孤啡肽受体mRNA 表达的变化，探讨电针对神经痛的治疗作用。方法 30只SD大鼠随机分为3组,每组10只，对照组为正常大鼠，自由生长;神经痛组为大鼠坐骨神经慢性限制性损伤致神经痛模型;电针组为术后第7天给予神经痛大鼠电针治疗30 min。各组动物处死后,取脊髓背角组织,冰冻切片,采用原位杂交的方法,观察各组脊髓背角Ⅰ～Ⅵ层内与痛觉相关孤啡肽受体mRNA的变化。结果 大鼠坐骨神经结扎后出现痛敏,电针能明显抑制大鼠痛敏，与神经痛组比较缩爪潜伏期(PWL)明显延长(P<0.01);对照组脊髓背角Ⅰ～Ⅵ层有少量孤啡肽 mRNA阳性细胞，神经痛组大鼠术后第7天时脊髓背角孤啡肽 mRNA阳性细胞数明显多于对照组，2组比较差异具有显著性(P<0.001);电针组脊髓背角Ⅰ～Ⅱ层、Ⅴ～Ⅵ层孤啡肽 mRNA阳性细胞数与神经痛组比较，差异具有显著性(P <0.05)。Ⅲ～Ⅳ层孤啡肽 mRNA阳性细胞数与神经痛组比较无显著性差异(P>0.05)。结论 电针对神经痛的治疗作用可能与脊髓背角内孤啡肽受体有关。

　　【关键词】 神经痛 电针 孤啡肽受体mRNA

　　Effect of electroacupuncture on neuropathic pain rats

　　FANG Cheng,SU Wei

　　1.Department of Anesthesia,the Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College,Xinxiang 453003,China;

　　2.Department of Pathology,Xinxiang Medical College,Xinxiang 453003,China

　　Abstract: Objective To observe the changes of orphanin receptor mRNA which was related with algesia in cornu dorsale medullae spinalis pre and post electroacupuncture and to investigate the therapeutical effect of electroacupuncture on neuralgia rats.Methods Thirty rats were divided into three groups,ten in each group.The control group was normal rats and growth freely.The rats in neuralgia group received the operation of chronic constriction injury on sciatic nerve.And electroacupuncture group were given electroacupuncture to treat for 30min at the seventh day after operation.Then sacrificed the rats in every group to get cornu dorsale medullae spinalis and to make frozen section.The changes of orphanin receptor mRNA which was related with algesia in cornu dorsale medullae spinalis were observed by hybridization in situ.Results Hyperalgesia appeared after ligating sciatic nerve of rats.Electroacupuncture could depress the hyperalgesia,and compared with neuralgia group,paw withdrawal latency of electroacupuncture group was significantly longer(P<0.01).There were little positive cells of orphanin receptor mRNA inⅠ～Ⅵ layer of cornu dorsale medullae spinalis.The positive cells of orphanin receptor mRNA in neuralgia group on the seventh day after operation were more than those in control group(P<0.001).There was significant difference between neuralgia group and electroacupuncture group in the number of positive cells of orphanin receptor mRNA in Ⅰ～Ⅱ layer and Ⅴ～Ⅵ layer(P<0.05),but there was no difference between two groups in the number of positive cells of orphanin receptor mRNA in Ⅲ～Ⅳ layer(P>0.05).Conclusion Therapeutical effect of electroacupuncture on neuralgia may be related with orphanin receptor in cornu dorsale medullae spinalis.

　　Key words: neuralgia;electroacupuncture;orphanin receptor mRNA

　　神经痛是指以沿周围神经通路及其分布区疼痛为主要特征的一种临床综合征，由周围神经根、神经节 、神经丛、神经干或其分支的原发或继发性损害(如代谢性或机械性等因素)引起痛觉过敏、痛性感觉异常、烧灼痛等感觉障碍，是临床上常见的顽痛现象之一[12]。电针对于慢性神经痛(例如坐骨神经痛)有良好的疗效[3]。多年来对电针镇痛的机制研究表明，电针是通过激活机体内源性痛觉调制系统，如阿片肽系统而起镇痛作用[4]。孤啡肽受体是1994年发现的阿片受体家族的一名成员,其内源性配基孤啡肽的结构与内阿片肽相似。孤啡肽受体mRNA在中枢神经系统内与痛觉相关的一些核团均有分布，提示孤啡肽通过激活其受体在痛觉调制中发挥作用。本实验拟在神经痛大鼠模型上观察脊髓背角内孤啡肽受体mRNA 在电针治疗前后表达的变化,探讨电针镇痛的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　雄性SD大鼠30只，由新乡医学院实验动物部提供，体质量(200±20)g，随机分为对照组，神经痛组和电针组，每组10只。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物模型的建立

　　神经痛组：大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，左侧后肢皮肤切开，肌肉钝性分离，暴露坐骨神经，40羊肠线松扎4道，致慢性限制性损伤(chronic constriction injury,CCI)神经痛大鼠模型，术后肌肉注射青霉素预防感染。采用336型辐射热测痛仪(IITC INC.Life Science Instrument,U.S.A.)测定大鼠的缩爪潜伏期(paw withdrawal latency,PWL)。电针组：CCI术后第7天神经痛大鼠给予电针治疗，安静环境中，室温(20±2)℃，将大鼠躯干固定于木架上，头部与四肢可自由活动，待大鼠静置20 min后，将针灸针刺入大鼠右侧“环跳”(GB30)与“阳陵泉”(GB34)穴，通过G68052型多功能电针治疗仪(上海医疗器械厂)给予“疏密波”，疏波频率约4 Hz，串长2.5 s，密波频率约60 Hz，串长5 s，强度以引起大鼠后肢肌肉轻微抖动而不嘶叫为宜(≤1 mA)，持续30 min。对照组：不予任何处理，自由生长。

　　1.2.2 测痛方法

　　在安静环境中，室温(20±2) ℃，将大鼠放入336型辐射热测痛仪的玻璃格子中，全身可以自由活动。待3组实验大鼠静置20 min后，用强光照射大鼠脚掌，测定大鼠的PWL，每间隔10 min测定1次，观察PWL变化。取3次测定结果的平均值作为测定结果。为防止大鼠热辐射烫伤，将PWL的上限值(cutoff time)定为20 s。电针组于电针后0 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min测定大鼠的PWL，同时测定神经痛组PWL进行比较。

　　1.2.3 切片

　　大鼠电针后8 h，戊巴比妥钠麻醉，左心室插管灌注固定，取脊髓腰膨大段作冰冻切片，选取大鼠脊髓背角Ⅰ～Ⅵ层作为主要观察部位，制备30 μm厚的冰冻冠状切片。

　　1.2.4 原位杂交

　　采用漂浮法[3]，脊髓片预处理后挑入含0.5 μg·mL-1地高辛标记的孤啡肽受体mRNA探针5′GGGGCAGGGATCTCCACCAGGCACTCGATCTCTTCATCTTCCACTTGTGC3′(由上海康成生物有限公司合成)的杂交液中，37 ℃反应20 h进行原位杂交。漂洗、显色封片后应用计算机图象分析系统进行阳性细胞计数(Leica Q 500JW Germany)。

　　1.3 统计学处理

　　SPSS 10.0计算机统计软件进行数据处理，所有数据均用均数±标准差(±s)表示，单因素方差分析进行数据比较，P<0.05为统计学有显著性差异。

　　2 结果

　　2.1 针刺镇痛效果

　　神经结扎术后第7天，神经痛组大鼠热痛敏稳定出现，神经痛组PWL为(6.34± 1.03)s，与对照组(10.03±0.83)s比较差异具有显著性(P<0.01)。电针组给予电针后PWL即开始延长，电针治疗后40 min PWL明显延长，达到最高值(12.54±1.03)s，同一时间神经痛组PWL为(9.53±1.44)s，2组比较有显著性差异(P<0.01)。90 min时电针组PWL恢复到电针前水平，见图1。

　　2.2 孤啡肽受体mRNA变化

　　原位杂交显示，孤啡肽受体mRNA阳性细胞呈紫蓝色，杂交阳性产物存在于胞浆中。对照组脊髓背角Ⅰ～Ⅵ层有少量孤啡肽mRNA阳性细胞，神经痛组大鼠术后第7天时脊髓背角孤啡肽mRNA阳性细胞数明显多于对照组大鼠(P<0.001);电针组脊髓背角Ⅰ～Ⅱ层、Ⅴ～Ⅵ层孤啡肽mRNA阳性细胞数与神经痛组比较具有显著性差异(P<0.05)，Ⅲ～Ⅳ层孤啡肽mRNA阳性细胞数与神经痛组比较无显著性差异(P>0.05)。见表1。表1 各组脊髓背角Ⅰ～Ⅵ孤腓肽mRNA阳性细胞数比较(略)

　　3 讨论

　　电针是临床上一种有效的镇痛方法，对于慢性痛包括坐骨神经痛有良好的疗效。临床上电针治疗神经痛效果良好，动物实验也有电针减轻糖尿病神经痛大鼠痛敏的报道。以往实验观察到，电针对于CCI神经痛大鼠的治疗，既有单次电针的即刻镇痛效应，也有多次电针的累加效应[5]。本实验显示，神经痛组大鼠PWL时间较为恒定，而电针组大鼠在给予用针后PWL即开始延长，40 min达到峰值，在此时间点与神经痛组比较，2组有显著差异。

　　对电针镇痛的机制研究表明，电针是通过激活机体内源性痛觉调制系统，如阿片肽系统而起镇痛作用。有实验表明给予不同的阿片受体拮抗剂能阻断电针对动物镇痛作用，从而提示电针的镇痛作用是通过阿片肽来实现的。实验动物给予电针后脑脊液中脑啡肽释放增加，PAG微量注射β内啡肽的抗血清能减弱电针的镇痛效应[6]，上述结果提示电针能够通过调节阿片肽系统的合成或释放来发挥其镇痛效应。本实验结果显示，神经痛大鼠给予电针后脊髓背角内孤啡肽受体mRNA阳性细胞数明显多于神经痛大鼠，提示电针能加强脊髓孤啡肽受体的合成。脊髓孤啡肽作为一种内源性镇痛物质，在电针的作用下合成进一步增加，其受体合成也相应增加，这可能是针刺镇痛的途径之一。

　　神经痛过程中，阿片受体数量下降，可能是吗啡镇痛效果下降的原因之一[7]。而本课题结果显示，神经痛大鼠脊髓孤啡肽受体合成增加，这种可塑性变化可能是孤啡肽对神经痛有良好治疗效果的基础。孤啡肽受体激活后能抑制腺苷酸环化酶及电压门控Ca2+通道，激活内向整合K+电流，直接对细胞产生抑制作用。当鞘内注射孤啡肽时，孤啡肽直接对脊髓背角神经元产生抑制作用，从而产生镇痛作用，这条途径可能是脊髓孤啡肽镇痛作用的通路之一。另外，大量实验表明，孤啡肽能抑制兴奋性传递。神经痛大鼠脊髓兴奋性传递增强，当鞘内给予孤啡肽时，对脊髓的谷氨酸传递产生抑制作用，从而发挥镇痛作用[8]。通过本实验结果推测，电针可通过孤啡肽系统影响脊髓背角神经元的兴奋性及谷氨酸传递而发挥其镇痛作用的。

　　综上所述，大鼠神经痛给予电针后发生可塑性变化，PWL可明显延长，表明电针对神经痛大鼠有明显的镇痛作用。而神经痛大鼠给予电针治疗后脊髓背角内孤啡肽受体mRNA明显升高，提示孤啡肽受体参与了电针镇痛，受体上调可能是电针镇痛的作用机制之一。

　　【参考文献】

　　[1]Zimmer A,Zimmer AM,Hohmann AG,et al.Increased mortality,hypoactivity,and hypoalgesia in cannabinoid CB1 receptor knockout mice[J].Proc Natl Acad Sci USA，2003,96(8):57805785.

　　[2]Pertwee RG.Pharmacology of cannabinoid CB1 and CB2 receptors[J].Pharmacol Ther，2005,74(1):129180.

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　　[4]Fox A,Kesingland A,Gentry C,et al.The role of central and peripHeral Cannabinoid 1 receptors in the antihyperalgesic activity of cannabinoids in a model of neuropathic pain[J].Pain，2001,92(1):91100.

　　[5]Wilson RI,Nicoll RA.Endogenous cannabinoids mediate retrograde signalling at hippocampal synapses[J].Nature，2001,41(3):588592.

　　[6]Varma N,Carlson GC,Ledent C.Metabotropic glutamate receptors drive the endocannabinoid system in hippocampus[J].J Neurosci，2006,21(2):188193.

　　[7]Zimmermann M.Pathbiology of neuropathic pain[J].Eur J Pharmacol，2004,429(1):2337.