胃癌鸟氨酸脱羧酶基因表达及临床意义

　　【摘要】 目的 从mRNA和蛋白质水平研究鸟氨酸脱羧酶在胃癌中的表达，探讨其在胃癌形成中的作用。方法 采用半定量RTPCR技术检测胃癌及相应癌旁组织中ODC mRNA的表达量，采用Westernblot在蛋白质水平检测胃癌及相应癌旁组织中ODC的表达量，并做统计学分析。结果 21例胃癌组织中ODC在mRNA和蛋白质水平的表达量均高于癌旁组织(P<0.01)。ODC的表达量低分化胃癌组织显著高于高中分化(P<0.01)。结论 ODC表达增强在胃癌发生发展中起重要作用，提示ODC可作为胃癌的基因诊断与治疗的靶点。

　　【关键词】 胃肿瘤;鸟氨酸脱羧酶;基因表达

　　YAN Yunfei， LIU Bin， XU Chunxiao， XIN Jiaxuan， WANG Wei， LIU Xianxi

　　(Institute of Biochemistry and Molecular Biology, School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, China)

　　To investigate expression of ornithine decarboxylase (ODC) in both mRNA and protein. Methods We extracted the total RNA from 21 surgically removed specimens of gastric cancer and normal mucosa close to lesions and conducted the reverse transcription polymerase chain reaction with optimal condition. Semiquantitatively we compared the mRNA expression level of ODC between malignant and normal mucosa. Total protein was extracted from the same 21 surgically removed specimens. Westernblot analysis was used to compare the protein expression level of ODC between cancer lesions and normal mucosa. Results mRNA and protein expressions of ODC in lesions of gastric carcinoma were significantly higher than those in contiguous normal mucosa(P<0.01). Conclusion ODC greatly influences the genesis and development of gastric cancer and may play a pivotal role in the metastasis and infiltration of cancer.

　　Key words： Stomach neoplasms; Ornithine decarboxylase; Gene expression

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 标本收集 2007年7月至2008年6月山东大学齐鲁医院普外科手术切除且经病理证实胃癌标本21例，其中高中分化10例，低分化11例。留取胃癌组织及距癌组织边缘5～8?cm的胃粘膜组织，常规处理后液氮速冻，置于-80低温冰箱保存。

　　1.1.2 试剂 Trizol试剂盒为日本Takara产品，反转录试剂盒为MBI FERMENTAS产品， ODC及βactin引物均为自行设计，由上海博亚公司合成，ODC引物：上游引物5′CCGTCTAGAATGAACAACTTTGGTAATGA3′,下游引物5′AGAAAGCTTCTACACATTAATACTAGCCG3′扩增片段为1?386?bp。βactin引物：上游引物5′CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC3′，下游引物5′TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT3′，扩增片段为250?bp。BCA assay reagent购自碧云天公司，鼠抗人ODC单克隆抗体购自Sigma公司，兔抗鼠多克隆抗体购自Dako公司，兔抗人βactin单克隆抗体、鼠抗兔βactin二抗均购自中山金桥公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 总RNA的提取 分别称取胃癌组织与癌旁组织各100?mg，参照TRIZOL(Takara公司)试剂提取说明书提取总RNA, UV2000紫外分光光度仪测260、280?nm吸光度，检测RNA纯度并计算RNA含量，-80?℃保存。

　　1.2.2 RTPCR分析ODC mRNA水平表达量 取3?μg?总RNA，参照FERMENTAS公司反转录试剂说明书用oliga dT合成cDNA。以cDNA为模板对ODC和βactin进行扩增，扩增体系为：50?μL反应体系含5?μL 2?μmol/L 的上游及下游引物,4?μL 25?mmol/L Mg2+,3?μL 10?mmol/L dNTP,1.25?U Taq DNA 聚合酶。94?℃ 5?min?预变性, 循环参数为94?℃ 40?s,56?℃ 40?s,72?℃ 1?min共28个循环。PCR产物在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳，结束后在含0.5?μg/μL EB的染色液中进行染色。应用凝胶成像分析系统(AlphaImage2200)对条带进行半定量分析,ODC基因的表达量通过扩增的βactin的表达进行校正,即以ODC/βactin比值作为ODC基因表达相对水平。然后计算癌组织和癌旁组织ODC基因mRNA表达量的比值(T/NODC)。

　　1.2.3 总蛋白的提取 分别称取胃癌组织与癌旁组织各100?mg，剪碎并匀浆，参照RIPA(碧云天公司)说明书向其中加入适量的裂解液，充分混匀后，在冰上静止10?min，4?℃17?105?g,离心10?min，抽取上清。参照BCA试剂盒(碧云天公司)检测上清液中蛋白质的浓度。

　　1.2.4 Westernblot分析ODC蛋白水平表达量 取蛋白与上样缓冲液混合，煮沸5?min，在12%的SDSPAGE胶中电泳分离，电转移至硝酸纤维素膜上，转后的膜封闭于5%脱脂奶粉的TBS溶液中(20?mmol/L TrisHCl，150?mmol/L NaCl，pH7.5)室温60?min。按比例加入对应一抗并在脱色摇床摇晃90?min，4?℃孵育过夜，然后用TBST(在TBS中加入20%的Tween)洗膜3次，每次10?min，按比例配制相应的二抗并将膜在摇床上孵育60?min，再用TBST洗膜3次，每次10?min。ECL发光液孵育，暗室曝光。应用凝胶成像分析系统(AlphaImage2200)对条带进行半定量分析,ODC 基因的表达量通过扩增的βactin进行校正,即以ODC/βactin 比值作为ODC基因表达相对水平。计算癌组织和癌旁组织ODC基因mRNA表达量的比值(T/NODC)。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS 12.0软件，结果以

　　2 结 果

　　2.1 胃癌中ODC mRNA的表达 21例癌组织ODC mRNA表达量均高于相应癌旁组织(图1)(P<0.01)，而且高中分化胃癌组织中ODC mRNA水平明显低于低分化胃癌组织(P<0.01)，见表1。表1 胃癌中ODC mRNA的表达量

　　3 讨 论

　　多胺包括精脒、精胺和腐胺，是一类天然长链脂肪族化合物，含有多个氨基和亚胺基。它广泛存在于生物体内，具有稳定细胞膜结构，直接控制RNA和DNA的生物合成，影响基因的表达与调控等一系列的作用[67]。ODC的活性形式是由两个亚基组成的二聚体酶，是多胺合成途径中的限速酶，它的作用是催化鸟氨酸脱羧生成腐胺，腐胺又可以顺序生成精脒和精胺。人基因组中包含两个ODC基因，其中一个位于7号染色体，另一个位于2号染色体短臂区，原癌基因Nmyc与核糖核酸酶M2也位于该区域，Nmyc基因的产物为核内的转录因子，核糖核酸酶是DNA合成中的关键酶。有研究发现，Nmyc和RRM2可与ODC基因共同扩增[89]。

　　大量资料证实ODC在大肠癌、食管癌、乳腺癌等恶性肿瘤中的活性都有升高。本实验室曾用酶学的方法测得大肠癌组织中ODC活性为同体癌旁组织的3.5倍左右[10]。本实验采用Westernblot的方法检测胃癌及其癌旁组织中ODC的表达量，结果显示胃癌组织中ODC蛋白含量为相应癌旁组织中的2倍左右，表明ODC蛋白含量增加与胃癌的发生相关。细胞内某种蛋白质的水平决定于蛋白质的生物合成速度与降解速度。为了判断胃癌组织中ODC蛋白含量的增加是否与合成速度有关，本研究又通过半定量的RTPCR方法检测了胃癌组织及其相应癌旁正常组织中ODC mRNA的含量，结果显示癌组织中ODC mRNA含量显著高于癌旁组织，提示胃癌组织中ODC基因表达速度增强，蛋白质生物合成加快，导致ODC蛋白含量增加。本研究还对不同病理分级的胃癌组织中ODC基因表达进行了分析，结果显示，恶性程度越高的癌组织其ODC基因的表达水平就越高。ODC基因的表达增强与胃癌的发生发展密切相关。

　　本研究表明，ODC基因的过表达与胃癌的形成、发展以及恶性程度有关，提示ODC可作为胃癌基因诊断与基因治疗的靶分子，为进一步研究胃癌的基因诊断与基因治疗的方法提供了理论依据。

　　【参考文献】

　　[1] 〖ZK(#]Subhi A L, Tang B, Balsara B R, et al. Loss of methylthioadenosine phosphorylase and elevated ornithine decarboxylase is common in pancreatic cancer[J]. Clin Cancer Res, 2004, 10(21): 72907296.

　　[2] 孙爱华，刘贤锡.大肠癌鸟氨酸脱羧酶基因表达及临床意义研究[J].中国现代普通外科进展，2004, 7(3):150151.

　　[3] Tian H, Liu X, Zhang B, et al. Adenovirusmediated expression of both antisense ornithine decarboxylase and Sadenosylmethionine decarboxylase inhibits lung cancer cell growth[J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2007, 39(6):423430.

　　[4] Deng W, Jiang X, Mei X, et al. Role of ornithine decarboxylase in breast cancer[J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai)， 2008, 40(3):235243.

　　[5] Young L, Salomon R, Au W, et al. Ornithine decarboxylase (ODC) expression pattern in human prostate tissues and ODC transgenic mice[J]. J Histochem Cytochem, 2006, 54(2):223229.

　　[6] Thomas T, Thomas T J. Polyamine metabolism and cancer[J]. Cell Mol Med, 2003, 7(2):113126.

　　[7] Sun H, Liu B, Wang W, et al. Adenovirusmediated expression of spermidine/spermine N1acetyltransferase gene induces Sphase arrest in human colorectal cancer cells[J]. Oncol Rep, 2008, 20(5):12201235.

　　[8] 张璐. 鸟氨酸脱羧酶及其在肿瘤治疗中的应用[J].国外医学临床生物化学与检验学分册, 1997,18(3):9799.

　　[9] Sistonen L, Holtta E, Lehvaslaiho H, et al. Activation of the neu tyrosine kinase induces the fos/jun transcription factor complex, the glucose transporter and ornithine decarboxylase[J]. J Cell Biol， 1989， 109(5): 19111919.