人PCAN1基因启动子的克隆及其上游调控区域的鉴定

　　【摘要】 目的 克隆人前列腺癌基因1(PCAN1)5′上游2.6?kb启动子片段，构建pGL3p2.6?kb载体, 测定其启动子活性，初步鉴定该片段内的DNA调控区域。方法 采用PCR法从人基因组DNA中扩增PCAN1基因5′上游2.6?kb启动子片段，并构建到荧光素酶报道基因载体pGL3basic中，构成pGL3p2.6?kb;瞬时转染前列腺癌细胞LNCaP，通过双荧光素酶活性检验测定PCAN1启动子活性。 使用Eraseasystem对pGL3p2.6kb载体中2.6?kb片段进行一系列5′侧翼缺失，产生12个缺失体，分别瞬时转染LNCaP细胞，通过检测荧光素酶的活性观察缺失突变对PCAN1启动子活性的影响。结果 克隆的PCAN1 2.6?kb启动子片段经测序鉴定正确无误; pGL3p2.6?kb转染LNCaP细胞后，双荧光素酶活性测定结果显示2.6?kb片段具有明显的启动子活性;5′缺失突变分析显示，PCAN1基因上游-1?599?bp?至-1?541?bp、-347?bp至-84?bp的缺失，与2.6?kb?片段相比，启动子活性分别升高2.24倍和2.53倍，-1?541?bp?至-1?226?bp的缺失，与2.6?kb片段相比，启动子活性降低2.11倍。结论 克隆的人PCAN1基因5′上游2.6?kb片段具有较强的启动子活性，PCAN1基因上游2.6?kb区域内分别存在2个负调控区和1个正调控区。

　　【关键词】 PCAN1基因; 启动区(遗传学);基因缺失;基因表达调控

　　its 5′ regulatory regions

　　LIU Wenwen1, ZHANG Ju2, GUAN Hengyun2, ZHANG Pengju2, CHEN Weiwen2, KANG Ludong2,

　　HU Xiaoyan2, WU Weifang2, JIANG Anli2

　　(1. OtolaryngologyHead and Neck Surgery, Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250022, China;

　　2. Institute of Biochemistry and Molecular Biology, School of Medicine, Shandong University， Jinan 250012, China)

　　To analyze the regulatory regions upstream of the human PCAN1 gene, a reporter plasmid containing of a 2.6?kb PCAN1 promoter was constructed by the PCR method, and DNA cisacting elements within this promoter were further identified. Methods A 2.6?kb fragment upstream of the PCAN1 gene was amplified by PCR using human genomic DNA as a template, and it was then inserted into the upstream of the luciferase reporter gene in pGL3basic vector to generate pGL3p2.6kb. Its promoter activity was determined with dualluciferase reporter assay after it has been transfected into prostate cancer LNCaP cells. A series of 5′ deletion mutantluciferase reporter plasmids derived from pGL3p2.6kb were obtained via Eraseabase System. The mutant plasmids were transfected into the LNCaP cells and the promoter activities were determined by dualluciferase reporter assay. Results The sequence of the 2.6?kb promoter fragment proved to be correct by DNA sequecing. Dualluciferase reporter assay showed that the 2.6?kb fragment presented a significant promoter activity with pRLTK into LNCaP cells. Analysis of the mutants showed that PCAN1 promoter activities increased 2.24fold and 2.53fold after the -1?599?bp to -1?541?bp and -347?bp to -84?bp within the promoter were deleted, while the promoter activity decreased 2.11fold after the -1?541?bp to -1?226?bp was deleted. Conclusion A cloned 2.6?kb fragment upstream of the PCAN1 gene presents strong promoter activity. With deletion analysis two negative and one positive regulatory region were identified within the promoter.

　　Key words: PCAN1 gene; Promoter regions (Genetics); Gene deletion; Gene expression

　　前列腺癌基因1(PCAN1)是新近发现的前列腺特异表达的基因, 又被称为前列腺差异表达基因(GDEP)[1]。PCAN1基因在正常前列腺上皮细胞中高度表达，可能在前列腺上皮分化中发挥作用[2]。PCAN1定位于染色体4q21，此区域在前列腺肿瘤中常杂合缺失，约35%的前列腺肿瘤标本中有PCAN1基因突变[3]，提示PCAN1基因有可能在前列腺肿瘤中作为肿瘤抑制基因发挥作用。但目前PCAN1在前列腺细胞分化及肿瘤发生中的确切机制及其基因表达调控机制尚不完全清楚。本课题克隆了人PCAN1基因5′上游启动区2.6?kb片段, 并检测了该片段的启动子活性，进一步构建了2.6?kb片段的一系列5′缺失体，观察缺失突变对PCAN1启动子活性的影响，初步鉴定该2.6?kb片段内的DNA调控区域。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 人基因组DNA自人静脉血白细胞中提取;LNCaP细胞由中国科学院细胞所提供;LA Taq DNA pol, Sac Ⅰ, Nhe Ⅰ, Kpn Ⅰ, Mlu Ⅰ, Hind Ⅲ购于大连宝生物工程有限公司;PCR引物由上海生物工程公司合成;pGL3basic载体、 pGL3control载体、pRLTK载体、双荧光素酶检测试剂盒、 Eraseasystem试剂盒购于Promega公司;Lipofectimine 2000 Reagent购于Invitrogen公司;QIAquick Gel Extraction Kit 购于Qiagen公司;1640培养基、胎牛血清购于Gibco公司;其他试剂为国产分析纯。

　　1.2 人基因组DNA的提取 按照文献[4]方法提取。

　　1.3 PCAN1基因5′上游2.6?kb启动子序列的扩增及纯化 根据基因数据库中PCAN1基因5′上游序列，设计一对引物PCANF：5′　CCCTAGCTAGCCATCTCTGCAGTCTCGAC　3′(下划线处为NheⅠ酶切位点), PCANR：5′　CCCAAGCTTCGCTCTGACTTCCTCTTC　3′(下划线处为Hind Ⅲ酶切位点), 使用LA Taq DNA pol,以人基因组DNA为模板, PCR扩增PCAN1基因5′上游2.6?kb片段(+32?bp～-2?598?bp)。PCR条件：96?℃ 2?min; 98?℃ 20?s; 68?℃ 10?min; 循环35次。最后1次延伸72?℃ 10?min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，切出2.6?kb?片段，经QIA quick Gel Extraction Kit回收纯化。

　　1.4 PCAN1启动子-荧光素酶报道基因质粒(pGL3p2.6?kb)的构建及测序 用限制性内切酶Nhe Ⅰ和Hind Ⅲ消化回收纯化的2.6?kb片段，插入到同样经Nhe　Ⅰ和Hind Ⅲ酶切后的pGL3basic载体中，构建成PCAN1启动子-荧光素酶报道基因质粒(pGL3p2.6?kb)，转化JM109感受态菌, 氨苄青霉素耐药筛选及酶切鉴定阳性克隆。用通用引物Rvprimer3和Glprimer2对2.6?kb片段进行测序。

　　1.5 PCAN1启动子5′缺失体-荧光素酶报道基因质粒(pGL3p2.6del)的构建 PCAN1基因启动子的5′系列缺失按照Eraseasystem试剂盒说明进行，其中pGL3p2.6?kb质粒先用Kpn Ⅰ消化，酚/氯仿抽提回收后再用Mlu Ⅰ消化，然后用Exo　Ⅲ对已经线性化的pGL3p2.6?kb进行5′缺失突变，突变温度30?℃，突变时间间隔为1?min，每个缺失完成后灭活Exo　Ⅲ,用S1核酸酶消化单链DNA，然后用Klenow大片段补平末端，最后用T4 DNA连接酶连接，构成12个5′端系列缺失的PCAN1 2.6?kb启动子缺失体-荧光素酶报道基因质粒(pGL3p2.6del1～pGL3p2.6del12)，转化JM109感受态菌, 氨苄青霉素耐药筛选及酶切鉴定阳性克隆，缺失位点与长度通过DNA测序确定。

　　1.6 前列腺癌LNCaP细胞的培养及转染 前列腺癌细胞株LNCaP细胞按1.5×105个/孔传代于24孔板，用含10%胎牛血清、100?U/mL青霉素及100?U/mL链霉?素的1640培养基，37?℃、5% CO2条件下培养。60?h后，细胞融合度>90%时用于转染实验。

　　按Lipofectimine 2000 转染试剂盒(Invitrogen)说明进行转染，每孔加pGL3p2.6kb或 pGL3p2.6del 1?μg、内参照pRLTK质粒0.04?μg、Lipofectimine 2000 2?μL、无血清无抗生素1640培基500?μL，双复孔检测。在检测pGL3p2.6kb中PCAN1启动子活性时同时进行pGL3basic、pGL3promoter和pGL3control与pRLTK共转染作为阴、阳性对照。转染后6?h，换正常1640培基，继续培养48?h后进行双荧光素酶活性测定。

　　1.7 双荧光素酶活性测定 按双荧光素酶活性检测试剂盒说明进行，弃掉细胞培养基，PBS冲洗细胞1次，加入细胞裂解缓冲液50?μL，放置室温10?min后，吹打细胞，收集细胞裂解液。双荧光测定：荧光测定管中加100?μL荧光素酶分析剂(LAR　Ⅱ)，再加细胞裂解液20?μL，放置发光仪中，测定pGL3中的firefly荧光素酶活性，读数为M1;然后再加入100?μL Stop & Glo reagent, 测定内参照质粒pRLTK中的Renilla荧光素酶活性，读数为M2。M1/M2为被检测质粒转染细胞后所测得的荧光素酶的相对活性。发光仪程序设置：延迟2?s，测定时间10?s。

　　1.8 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，数据统计以±s表示。两组间均数的比较采用t检验，多组间均数的比较采用方差分析，如发现显著性差异，采用q检验进行两两比较。P<0.05 为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 PCAN1启动子-荧光素酶报道基因质粒pGL3p2.6kb的酶切鉴定及测序 见图1。重组阳性pGL3p2.6?kb质粒经Sac　Ⅰ酶切得到1.4?kb和6.0?kb片段，经Nhe Ⅰ和Hind Ⅲ酶切得到2.6?kb的插入片段和4.8?kb?的空载体，经Hind Ⅲ酶切开环得到7.4?kb片段，酶切结果与预期结果相符。经Rvprimer3和Glprimer2引物测序2.6?kb全长序列，其序列正确无误。

　　2.2 PCAN1启动子活性测定 见图2。pGL3p2.6?kb质粒转染LNCaP细胞48?h后收集细胞，进行双荧光素酶报告基因检测。pGL3p2.6?kb的相对荧光素酶活性M1/M2为0.49，pGLbasic、 pGL3promoter、pGL3control的相对荧光素酶活性M1/M2分别为0.05、0.7、1.5。 因此PCAN1基因上游2.6?kb片段具有明显的启动子活性，是pGL3basic活性的10倍，是pGL3promoter质粒中SV40启动子活性的70%。

　　2.3 PCAN1启动子缺失体-荧光素酶报道基因质粒pGL3p2.6del的酶切鉴定及测序 使用Eraseasystem构建12个PCAN1启动子缺失体-荧光素酶报道基因质粒，从克隆的pGL3p2.6?kb载体上2.6?kb?片段的5′端进行系列缺失，缺失后剩余片段的长度依次为：2.40、2.24、1.99、1.80、1.63、1.57、1.26、1.03、0.83、0.72、0.38、0.12?kb,将相应的质粒依次命名为pGL3p2.6del1～pGL3p2.6del12。将12个重组的pGL3p2.6del质粒经Hind Ⅲ酶切鉴定，片段大小符合预计结果，经测序鉴定12个缺失突变体序列正确无误，见图3。

　　2.4 PCAN1启动子缺失体的启动子活性测定 见图4。为了鉴定PCAN1启动子2.6?kb片段中是否含有调节启动子活性的重要DNA元件，将构建的12个启动子缺失体荧光素酶报道基因质粒(pGL3p2.6del1～pGL3p2.6del12)分别转染前列腺癌LNCaP细胞, 48?h后测定荧光素酶表达活性，观察缺失突变对启动子活性的影响。PCAN1基因上游-1?599?bp至-1?541?bp片段、-347?bp至-84?bp片段的缺失，与2.6?kb片段相比，启动子活性分别升高2.24倍和2.53倍，表明在这两个区域可能分别存在1个负调控元件;-1?541?bp至-1?226?bp片段的缺失，与2.6?kb?片段相比，启动子活性降低2.11倍，表明此区域可能存在1个正调控元件。

　　3 讨 论

　　PCAN1是在筛选前列腺特异基因时被发现的一种在前列腺上皮组织高度表达的基因，在前列腺癌的起始和发展中发挥重要作用[5]，PCAN1在前列腺肿瘤样本中经常缺失，且在前列腺肿瘤和正常前列腺组织中呈现差异表达，证明该基因具有肿瘤抑制作用。Cross等[6]在PCAN1基因的内含子区域鉴定了3个增强元件，但关于PCAN1表达调控的机制并不十分清楚。本课题首次利用PCR技术扩增了人PCAN1基因5′上游启动区2.6?kb片段, 检测了该片段的启动子活性，并初步鉴定了该片段内的DNA调控区域, 为进一步研究PCAN1基因的表达调控，探讨其在前列腺发育及前列腺癌中的作用，探寻前列腺特异启动子奠定了基础。

　　本实验将克隆获得的PCAN1基因上游5′侧翼区的2.6?kb的片段插入到荧光素酶报道基因质粒pGL3basic中的荧光素酶报道基因上游, 构建重组的报道基因质粒pGL3p2.6?kb, 使用双荧光素酶报道基因技术检测了其启动子活性。双荧光素酶报道基因分析系统是在一个系统中测量两个单独的荧光素酶报告基因，将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达，将海肾荧光素酶作为内对照报告基因，提供实验报告基因测试的归一化。归一化处理可消除实验中不同测试间所固有的变化，这些变化可干扰实验准确度，其中包括培养细胞的数目及活力的差异，细胞转染及裂解的效率。本实验中用来作为阴性对照的pGL3basic质粒无启动子和增强子，而作为阳性对照的pGL3control质粒含有SV40启动子和增强子，pGL3promoter用来作为参照质粒，含有比较强的SV40启动子，将pGL3p2.6?kb与内参照质粒pRLTK共转染入前列腺癌LNCaP细胞后, 荧光素酶检测系统显示pGL3p2.6?kb启动子活性分别是pGL3basic和pGL3promoter中启动子活性的10倍和70%，表明克隆获得的PCAN1基因上游的2.6?kb片段具有较强的启动子活性。 使用MatInspector软件分析该2.6?kb片段上可能存在的转录因子的结合位点，发现其中可能存在超过500个转录因子的结合位点(同源性>75%)，然而在这段假定的启动子区域却没有发现典型的TATAbox。

　　突变分析是用来鉴定DNA片段中是否含有重要的功能性调控元件的常用方法，其中缺失突变可以产生启动子片段或DNA片段的一系列5′缺失体或3′缺失体或内缺失体，分析缺失片段对启动子活性的影响，可以确定涉及调控的DNA区域。在本课题中，主要对PCAN1启动区的 2.6?kb片段进行了一系列的5′缺失突变。通过缺失突变分析发现，在PCAN1基因上游-1?599?bp至-1?541?bp片段、-347?bp?至-84?bp片段2个区域可能分别存在1个负调控元件;-1?541?bp至-1?226?bp片段区域内可能存在1个正调控元件。进一步工作将鉴定PCAN1基因的核心启动子区域，且根据MatInspector软件分析结果，针对有关的转录因子结合位点进行突变实验分析及转录因子结合实验，将有可能发现特异性调控PCAN1基因转录的反式作用因子，为揭示该基因组织特异性表达及研究其基因表达调控的机制奠定基础。

　　【参考文献】

　　[1] Olsson P, Bera T K, Essand M, et al. GDEP, a new gene differentially expressed in normal prostate and prostate cancer[J]. Prostate, 2001, 48(4):231241.

　　[2] Cross D, Reding D J, Salzman S A, et al. Expression and initial promoter characterization of PCAN1 in retinal tissue and prostate cell lines[J]. Med Oncol, 2004, 21(2):145153.

　　[3] Reding D J, Zhang K Q, Salzman S A, et al. Identification of a gene frequently mutated in prostate tumors[J]. Med Oncol, 2001, 18(3):179187.

　　[4] Sambrook J, Russell D W. Third Edition. Molecular Cloning[M]. New York: Cold Spring Harbor, 2001: 628.

　　[5] Vasmatzis G, Essand M, Brinkmann U, et al. Discovery of three genes specifically expressed in human prostate by expressed sequence tag database analysis[J]. Proc Natl Acad Sci, 1998, 95(1):300304.