普萘洛尔和哌唑嗪对应激大鼠的保护作用

　　【摘要】 目的 观察肾上腺素能受体拮抗剂普萘洛尔和哌唑嗪对慢性轻度不可预知应激模型(CUMS)大鼠行为学及急应激暴露后血清皮质酮水平(CORT)、中枢海马诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响，探讨其应激保护作用。方法 健康成年Wistar雄性大鼠32只，随机分为4组：空白对照组、CUMS组、普萘洛尔组和哌唑嗪组。CUMS造模前后，用旷场实验测各组大鼠的行为学变化。造模结束后，应激动物接受1.0?mA，5?s，持续60次的急性电击刺激，2?h?后断头处死。放射免疫分析法测大鼠血清皮质醇含量换算成皮质酮含量;Western blot测中枢海马中iNOS表达量。结果 与对照组比较，普萘洛尔组大鼠水平运动得分、竖立次数和修饰次数减少(P<0.05)，中枢海马iNOS表达量明显增加(P<0.01);哌唑嗪组大鼠与对照组比较无明显差异，血清CORT水平明显高于普萘洛尔组(P<0.05)。结论 哌唑嗪可明显改善CUMS模型大鼠的行为学改变，有利于应激个体再次遭遇急性应激时CORT的调动，减轻应激导致中枢海马损伤的程度。普萘洛尔可缓解应激时的焦虑水平，但不能扭转应激对中枢海马的损伤。

　　【关键词】 慢性轻度不可预知应激;应激;皮质酮;一氧化氮合酶;大鼠，Wistar

　　YANG Lejin, LIU Xin, JIANG Hong, FAN Shujuan, LU Yanxia, LIU Meng, PAN Fang

　　(Department of Medical Psychology, School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, China)

　　To explore the effects of adrenoceptor antagonists, propranolol and prasozin on chronic unpredictable mild stress (CUMS) rats, serum corticosterone (CORT)level and hippocampal inducible nitric oxide synthase level(iNOS) following acute stress. Methods Thirtytwo Wistar male rats were randomly divided into four groups： the control group, the CUMS group, the propranolol group and the prasozin group. The behavior of all rats was determined in an openfield test before and after CUMS. Animals were sacrificed by decapitation 2h after an acute stress of 1.0?mA, 5?s, persisting 60 times. The content of serum CORT was evaluated by cortisol RIA, and iNOS was measured by western blot. Results Compared with the controls, the propranolol group exhibited a decreased square crossing number, rearing score and grooming number(P<0.05) and an increased iNOS level in the hippocampus(P<0.01). There was no statistical difference between the prasozin group and the control group. Serum corticosterone of the prasozin group was higher than that of the propranolol group(P<0.05). Conclusions Prasozin could improve the behavior of CUMS rats and upregulates the CORT level after exposure to acute stress, it also reverses impairment of the hippocampus produced by stress. Although propranolol could alleviate anxiety in stress, it could not reverse the impairment of the hippocampus produced by stress.

　　Key words: Chronic unpredictable mild stress; Stress; Corticosterone; Nitric oxide synthase; Rats, Wistar

　　大量研究证实，应激不仅与多种躯体疾病的发生密切相关[1]，还是许多精神障碍如抑郁症、创伤后应激障碍等发病的主要危险因素[23]。心理、生理和环境应激源作用于机体，通过兴奋下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(hypothalamicpituitaryadrenal axis, HPA)和交感神经-肾上腺髓质轴(sympathoadreno medullary, SAM)产生生理病理性改变，对内环境稳态的平衡产生威胁[4]。有研究证实，两轴协调性的交互作用可明显改善机体面对各种应激源时的生理状态，降低其活动可提高应激动物的存活率[5]。本实验通过应激前给予肾上腺受体拮抗剂哌唑嗪和普萘洛尔改变SAM轴的功能，通过慢性轻度不可预知模型(chronic unprodictable mild stress, COMS)观察不同肾上腺素能受体拮抗剂对大鼠行为学、血清皮质酮水平(corticosterone, CORT)和中枢海马中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)表达的影响，探讨其应激保护作用的差异。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠，2月龄，体质量200～220?g，由山东大学实验动物中心提供。适应性饲养1周，室温(20±3)℃，光—暗周期12?h/12?h，湿度40%～70%。

　　1.2 仪器与试剂 MGB型迷宫刺激器(江苏三兴教学机械厂);盐酸普萘洛尔片(天津力生制药股份有限公司);盐酸哌唑嗪片(北京双鹤现代医药技术有限责任公司);血清皮质醇放射性免疫试剂盒(南京建成生物技术公司);兔抗iNOS多克隆抗体(SANTA CRUZ公司)，兔抗βactin多克隆抗体(SANTA CRUZ公司);辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司);PVDF膜(0.45?μm，Millipore公司)。

　　1.3 动物分组及处理 利用旷场实验进行行为学评分，旷场实验水平运动和垂直运动总得分低于30分和高于120分的动物予以剔除，选择得分相近大鼠32只，按随机原则分为4组：对照组8只，正常饲养，生理盐水1.0?mL灌胃;CUMS模型组8只，按程序给予应激刺激，应激前半小时生理盐水1.0?mL灌胃;普萘洛尔组8只，将盐酸普萘洛尔片[10?mg/(kg·d)]溶于1.0?mL生理盐水中，每天于应激前半小时灌胃;哌唑嗪组8只，将盐酸哌唑嗪片[1?mg/(kg·d)]溶于1.0?mL生理盐水中，每天于应激前半小时灌胃。

　　1.4 模型制备 ①慢性轻度不可预知性应激模型：在21?d内，除对照组所有大鼠随机接受7种不同的刺激：禁水(24?h);禁食(24?h);夹尾(1?min);昼夜颠倒24?h;水平振荡(1次/s,总15?min);噪音(1?500?Hz,92?dB,1?h);束缚(将大鼠置于25?cm×7?cm的塑料箱子内，持续1?h)，每种刺激在21?d内出现3次。每天给予一种刺激，给予的时间也是随机安排，以保证应激在时间和方式上的不可预知性。②急性应激模型：第22天，模型建立结束后，所有大鼠接受电击刺激：电流为1.0?mA，持续刺激5?s,间歇55?s，共60次[6]。

　　1.5 行为学测定 旷场实验：实验装置为一底面100?cm×100?cm，高40?cm的木箱，底面被等分为25个正方形方格。于实验第1、7、22天的7：30～l2：00之间在安静、光线均匀的房间内进行。实验开始后，将大鼠放于中央方格内观察大鼠的中央格停留时间，5?min内的穿越格数(四爪均进入的方格方可计数，水平运动得分)，直立次数(双前爪腾空或攀附墙壁，垂直运动得分)，清洁运动次数，粪便颗粒数。用5%的酒精清洁旷场后再进行下一只大鼠的观测。

　　1.6 血清CORT测定 每组大鼠接受急性应激后2?h[7]?断头处死，取血，3?000?r/min离心10?min，取上清，放射免疫分析法测定血清皮质醇含量。皮质酮含量由皮质醇测定值换算得来，换算公式：血清皮质酮浓度=血清皮质醇浓度×50(原理：皮质酮是啮齿类动物主要的糖皮质激素，大鼠血清皮质酮含量与皮质醇含量比恒定，约为50∶1)

　　1.7 Western blot检测iNOS蛋白表达 动物断头处死后，在冰面上剥离大鼠海马组织，置-80?℃保存。将组织按比例加入裂解液RIPA(50?mmol Tris, 150?mmol NaCL, 0.1% SDS, EDTA等)和PMSF的混合液，匀浆，4?℃，12?000?r/min 离心10?min,离心半径为9.13?cm,留取上清液。用BCA蛋白质定量测定试剂盒测定蛋白浓度。按每孔25?μg蛋白上样行SDSPAGE凝胶电泳，蛋白转移到PVDF膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭1?h，加入兔抗iNOS多克隆抗体(1∶800),4?℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(1∶10?000)室温孵育1?h, 洗膜3次后，加ECL暗室曝光1～5?min，显色条带用Scion Image软件进行灰度分析。以βactin作为内参，目的蛋白条带与βactin条带灰度值比值代表目的蛋白相对表达量。

　　1.8 统计学处理 采用SPSS13.0软件行单因素方差分析及Sigmaplot10.0画图。数据以±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 旷场实验结果 21?d CUMS造模结束后，与对照组比较，CUMS组中央格停留时间延长，竖立次数减少(P<0.05)，水平穿越格数明显减少(P<0.01);普萘洛尔组水平穿越格数、竖立次数和清洁运动次数减少(P<0.05);哌唑嗪组与对照组各指标之间差异无统计学意义。与CUMS组比较，普萘洛尔组修饰次数减少(P<0.05)，水平穿越格数、竖立次数增加，中央格停留时间和粪便颗粒数减少，但差异无统计学意义;哌唑嗪组中央格停留时间减少，竖立次数增加(P<0.05)，水平穿越格数明显增加(P<0.01)。普萘洛尔组与哌唑嗪组比较，水平穿越格数、竖立次数和修饰次数减少(P<0.05)。见表1。中央格停留(t/s)穿越格数竖立次数修饰次数粪便粒数对照组

　　2.2 血清皮质酮测定结果 与对照组比较，CUMS组和普萘洛尔组CORT水平呈下降趋势，哌唑嗪组CORT水平呈上升趋势，但差异均无统计学意义。普萘洛尔组血清CORT水平显著低于哌唑嗪组(P<0.05)。见图1。

　　各组血清皮质酮水平比较(*Comparison of the serum corticosterone level in each groups

　　2.3 中枢海马iNOS表达 与对照组比较，CUMS组和普萘洛尔组中枢海马中iNOS表达量明显升高(P<0.01)。CUMS组和普萘洛尔组海马中iNOS表达量明显高于哌唑嗪组(P<0.01)。见图2。

　　3 讨 论

　　HPA轴和SAM轴在应激过程中被激活，两轴持续性活动释放大量CORT和儿茶酚胺类物质进入循环，产生应激性损伤效应[8]。本研究通过在应激前部分阻断SAM轴，从而间接抑制应激过程中HPA轴兴奋性的升高，观察该处理是否改善大鼠行为学表现和中枢神经组织的损害情况。

　　本实验采用慢性轻度不可预知应激造模，该模型模拟人类在日常生活中可能遭遇的应激源，是一种具有良好信度和效度的动物模型[9]。造模结束后的旷场实验结果显示，CUMS组大鼠较对照组呈明显的抑郁性改变，说明模型建立成功,但修饰次数没有明显差异，其原因仍需进一步研究。与对照组比较，普萘洛尔组大鼠行为学改变有改善趋势，提示其对慢性应激暴露大鼠具有一定的抗焦虑作用，该结果与以往的研究一致[10];哌唑嗪处理可明显改善大鼠的抑郁性行为改变。

　　慢性应激激活HPA轴，后者兴奋性提高，释放CORT。Bachis A等[11]的研究提示，慢性轻度不可预知应激可引起大鼠血清CORT水平明显升高，并且随着应激时程的延长CORT水平不断升高，说明CUMS可引起HPA轴动力学改变，被广泛认可的解释是慢性应激使HPA轴功能持久亢进，引起CORT水平增高，而后者的损伤性效应导致HPA轴的负反馈作用受到抑制，造成HPA轴功能紊乱[12]。另有研究证实，“猫暴露”、电击等急性应激可引起血清CORT水平的显著性升高，而肾上腺切除大鼠血清CORT较对照组无明显变化[1314]，说明大鼠面对急性应激刺激时，通过兴奋HPA轴产生大量CORT，因此，个体面临急性应激刺激时，血清CORT水平的调动反映HPA兴奋性的高低，以及个体在应激时应对能力的储备状况[15]。本研究中，CUMS组大鼠和普萘洛尔组大鼠血清CORT水平较对照组有下降趋势，而普萘洛尔组与哌唑嗪组比较，CORT水平明显下降，可能的解释为慢性不可预知应激致使大鼠的HPA轴功能紊乱，当其再次遭遇急性应激刺激时，功能紊乱的HPA轴无法充分调动，于是体现血清中CORT水平较对照组和哌唑嗪组降低，这提示，α1肾上腺素能受体拮抗剂哌唑嗪较β受体拮抗剂普萘洛尔的应激保护作用强。

　　海马特殊的敏感性使其在应激过程容易受到损害，应激可引起海马形态学和功能的改变，并使海马iNOS的表达发生改变。iNOS参与病理性应激反应，可在胶质细胞等多种细胞中表达，iNOS的表达可引起持续大量的一氧化氮(nitric oxide， NO)的产生，高浓度的NO具有细胞毒性，可加速神经元的凋亡，同时有研究显示，海马iNOS的高表达还与应激导致的抑郁样行为改变有关[1617]。本研究结果提示，CUMS组与对照组比较，海马iNOS表达显著性增加，哌唑嗪组无明显升高，提示哌唑嗪对海马细胞起到了有效的保护作用，普萘洛尔组海马iNOS表达明显升高，但与CUMS组比较无差异，说明普萘洛尔不能逆转海马细胞应激过程中的损伤。由此可见，α1肾上腺素能受体拮抗剂哌唑嗪，能够明显改善CUMS模型大鼠的抑郁性行为改变，有利于模型鼠再次遭遇急性应激性事件时体内CORT水平的调动和显著性降低中枢海马中iNOS的表达，具有明显的应激保护作用。

　　【参考文献】

　　[1] Gillespie C F, Nemeroff C B. Hypercortisolemia and depression[J]. Psychosom Med, 2005, 67(1):2628.

　　[2] Anisman H, Matheson K. Stress, depression, and anhedonia: caveats concerning animal models[J]. Neurosci Biobehav Rev, 2005, 29(45):525546.

　　[3] Miller M M, McEwen B S. Establishing an agenda for translational research on PTSD[J]. Ann NY Acad Sci, 2006, 1071:294312.

　　[4] Maier S F, Watkins L R. Cytokines for psychologysts: Implications for bidirectional immunetobrain communication for understanding behaveour, mood, and cognition[J]. Psychol Rev, 1998, 105(1):83107.

　　[5] Greenberg N, Carr J A, Summers C H. Causes and consequences of stress[J]. Integr Comp Biol, 2002, 2(3):508516.

　　[6] Will M J, Der Avakian A, Bland S T. Electrolytic lesions and pharmacological inhibition of the dorsal raphe nucleus prevent stressor potentiation of morphine conditioned place preference[J]. Psychopharmacology, 2003, 171(2):191198.

　　[7] Campisi J, Ted H, Lee M, et al. Habitual physical activity facilitates stressinduced HSP72 induction in brain, peripheral, and immune tissues[J].

　　[10] Adamec R, Muir C, Grimes M, et al. Involve ment of noradrenergic and corticoid receptors in the consolidation of the lasting anxiogenic effects of predator stress[J]. Behav Brain Res, 2007, 179(2):192207.

　　[11] Bachis A, Cruz M I, Nosheny R L, et al. Chronic unpredictable stress promotes neuronal apoptosis in the cerebral cortex[J]. Neurosci Lett, 2008, 442(2):104108.

　　[12] 王子梅. ACTH激素分泌调节新进展[J]. 国外医学内分泌学分册，1994,14(4)：171174.

　　[13] Fleshner M, Campisi J, Amiri L, et al. Cat exposure induces both intra and extracellular Hsp72: the role of adrenal hormones[J]. Psychoneuroendocrinology, 2004, 29(9):11421152.

　　[14] Louvart H, Maccari S, Ducrocq F, et al. Longterm behavioural alterations in female rats after a single intense footshock followed by situational reminders[J]. Psychoneuroendocrinology, 2005, 30(4):316324.

　　[15] van Stegeren A H, Wolf O T, Everaerd W, et al. Endogenous costisol level interacts with noradrenergic activation in the human amygdala[J]. Neurobiol Learn Mem, 2007, 87(1):5766.

　　[16] Wang D, An S C, Zhang X. Prevention of chronic stressinduced depressionlike behavior by inducible nitric oxide inhibitor[J]. Neurosci Lett, 2008, 433(1):5964.

　　[17] Abramson S B, Amin A R, Clancy R M, et al. The role of nitric oxide in tissue destruction[J]. Best Pract Res Clin Rheumatol, 2001, 15(5):831845.