二氮嗪、环孢菌素A拮抗Aβ142致胆碱能神经元凋亡的研究

　　【摘要】 目的 研究ATP敏感性钾离子通道开放剂二氮嗪、环孢菌素A及两者协同对β淀粉样蛋白(Aβ142)致原代培养基底前脑胆碱能神经元凋亡的影响。方法 采用2?μmol/L的Aβ142对原代培养大鼠胆碱能神经元进行干预，建立阿尔茨海默病(AD)细胞凋亡模型;采用500?μmol/L二氮嗪(预处理1?h)、20?μmol/L环孢菌素A以及两者协同对其干预，作用不同时间(24、72?h)后置于倒置显微镜下观察细胞形态;采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率，Western blot法检测细胞内凋亡相关蛋白表达水平的变化。结果 ① Aβ142作用胆碱能神经元72?h后，Bcl2表达量降低(P<0.01)，细胞色素C、Caspase3、Cleaved caspase3的表达量增加(P<0.01，P<0.001，P<0.01)，Bax未见明显变化，Bcl2/Bax比值降低(P<0.01)，细胞形态发生明显损伤性变化，细胞存活率明显降低(P<0.001);② 二氮嗪、环孢菌素A以及两者协同作用24?h后Bcl2的表达增加(P<0.05， P<0.01，P<0.01)，作用72h能明显增加Bcl2的表达(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，并提升Bc2/Bax比率而抑制细胞色素C、Caspase3、Cleaved caspase3表达量(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，细胞存活率均增高(P<0.01，P<0.001)。结论 Aβ142作用胆碱能神经元72?h能促使细胞凋亡，二氮嗪与环孢菌素A及两者协同可以明显拮抗Aβ142致细胞凋亡作用。

　　【关键词】 淀粉样β蛋白;二氮嗪;环孢菌素;胆碱能神经元; ATP敏感性钾离子通道;大鼠，Wistar

　　forebrain cholinergic neuron apoptosis induced by Aβ142

　　JIANG Liangliang1, FU Qingxi2, WANG Ruixia1, MA Guozhao1,

　　GAO Jianxin3, LIU Kejing3, ZHANG Yong1

　　(1. Department of Neurology, Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, China;

　　2. Linyi People′s Hospital, Linyi 276003, Shandong, China;

　　3. Department of Physiology, School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, China)

　　To investigate the effects of diazoxide (ATPsensitive potassium channel opener) and cyclosporine A and their combination on apoptosis induced by betaAmyloid protein (Aβ142) on cultured primitive rat basal forebrain cholinergic neurons. Methods The cell apoptosis model was induced by Aβ142(2?μmmol/L), and then 500?μmol/L diazoxide, 20?μmol/L cyclosporine A and their combination were used to interfere with it. Cell morphology was observed by an inverted microscope, changes of cell apoptosis were determined by MTT, and expressions of target proteins (bcl2, bax, cytochrome C, caspasce3 and Cleaved Caspase3) were determined by Western blot when the neurons were interfered with by the drugs for different times (24, 72?h). Results ① Being exposed to Aβ142 for 72?h, cell activity remarkably decreased(P<0.001), expression of Bcl2 decreased (P<0.01) and expressions of cytochrome C, caspasce3 and Cleaved Caspase3 increased(P<0.01, P<0.001， P<0.01). Expression of Bax had no change but the value of Bcl2/Bax decreased(P<0.01). ② Expression of Bcl2 increased when the cell apoptosis model was exposed to diazoxide, cyclosporine A and their combination for 24?h(P<0.05， P<0.01，　P<0.01). When the cell apoptosis model was exposed to diazoxide, cyclosporine A and their combination for 72?h, expression of Bcl2 obviously increased (P<0.05, P<0.01, P<0.001), expressions of Cytochrome C, Caspasce3 and Cleaved Caspase3 decreased(P<0.05, P<0.01, P<0.001), and cell activity increased(P<0.01, P<0.001). Conclusion Being exposed to Aβ142 for 72?h，　neuron apoptosis occurs. Diazoxide and cyclosporine A and their combination could protect neurons from apoptosis induced by Aβ142.

　　Key words： Amyloid betaprotein; Diazoxide; Cyclosporine; Cholinergic neuron; ATPsensitive potassium channel; Rats, Wistar 目前研究[13]发现，ATP敏感性钾离子通道(ATPsensitive potassium channel)开放剂二氮嗪和环孢菌素A对多种损伤因素导致的细胞损伤与凋亡具有保护作用，本研究通过细胞原代培养的方法体外培养胆碱能神经元，并以2?μmol/L(终浓度)的Aβ142对原代培养胆碱能神经元进行诱导，建立阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)细胞凋亡模型，利用二氮嗪与环孢菌素A及两者协同对其进行干预，试图从多重位点多重机制联合稳定线粒体膜渗透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)的功能状态，研究其是否能拮抗Aβ142致胆碱能神经元的凋亡作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 实验动物 实验用Wistar孕鼠16只，孕16～18?d，体质量300～350?g，由山东大学实验动物中心提供。

　　1.1.2 实验试剂 Aβ142、二氮嗪、环孢菌素A、多聚赖氨酸、MTT购自美国Sigma公司;胎牛血清及DMEM/F12培养基购自海克隆公司;羊抗大鼠胆碱乙酰转移酶(Choactase)、细胞色素C、Bcl2和Bax单克隆抗体及相应二抗、发光试剂(ECL)购自Santa Cruz公司;Caspase3、Cleaved caspase3多克隆抗体及相应二抗由Cell signaling公司提供;戊巴比妥钠、阿糖胞苷、细胞裂解液(RIPA)、BCA法蛋白定量试剂盒系上海申能博彩公司生产。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 基底前脑胆碱能神经元培养 戊巴比妥钠(40?mg/kg)经腹腔麻醉Wistar孕鼠，在无菌条件下操作取出胎鼠，用显微镊子分离出基底前脑，置于DHank?液中在光学显微镜下剥除脑膜，再将脑组织剪成碎块， 0.125%胰酶37?℃消化20?min，用含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化。低温，300×g，离心3?min，重复2次，吸管吹打制成单个细胞悬液，接种到0.05?mg/mL多聚赖氨酸包被的12孔板(接种密度6×105/mL，1?mL/孔)、96孔板(接种密度5×104/mL，200?μL/孔)及培养皿(接种密度2×106/mL，3?mL/皿)中，37?℃、5%CO2孵箱中培养，第3～5天加抑制胶质细胞分裂的阿糖胞苷(终浓度为5?μmol/L)。

　　1.2.2 胆碱能神经元的鉴定 采用胆碱乙酰转移酶 (choline acetyltransferase，ChAT)免疫细胞化学鉴定的方法。具体步骤：细胞爬片(12孔板内放置处理过的载玻片)7?d后，在4%多聚甲醛(4?℃)中固定30?min，PBS 洗3次，每次5?min，加特异性一抗(1∶100羊抗大鼠ChAT抗体)，在湿盒中4?℃过夜，PBS洗3次，每次5?min，加偶联二抗(1∶200生物素标记的兔抗山羊抗体)，室温30?min，PBS洗3次，每次5?min，加SABC 20?min，PBS洗4次，每次5?min，DAB显色5?min，苏木素复染，流水冲洗，常规脱水、透明、中性树胶封固，光学显微镜下观察。

　　1.2.3 分组及药物处理 Aβ142人工重组蛋白质 (0.1?mg)，溶解于0.5?mol/L二甲基亚枫中，500?μL磷酸盐缓冲液(pH值7.4)稀释，即为Aβ142原液。将原液置于37?℃恒温箱内孵育36?h，进行老化处理，然后4?℃贮存备用，用时稀释。实验分为A组: 空白对照组;B组：Aβ142干预组;C组：Aβ142+二氮嗪预处理干预组;D组：Aβ142+环孢菌素A干预组;E组：Aβ142+二氮嗪预处理+环孢菌素A干预组。细胞培养至第7天，C 组和E组换含有500?μmol/L二氮嗪的培养液，其余各组换取正常培养液。作用1?h后，B组和C组换取含Aβ142(2?μmol/ L)的培养液，A组换取含等量的磷酸盐缓冲液的培养液，D组和E组换取含Aβ142(2?μmol/ L)+20?μmol/L环保菌素A的培养液，分别再培养24?h和72?h。

　　1.2.4 细胞形态学观察 分别于药物干预24?h和72?h后把各组培养细胞置于显微镜下观察细胞形态并摄像，随机取20个视野计数单个视野神经元数和轴突数，利用显微测量法测量每个神经元轴突长度。

　　1.2.5 细胞存活率测定 采用四唑盐(MTT)比色法检测培养细胞的存活率。将上述96孔板培养各组细胞及设立的空白调零组(与试验平行不加细胞只加培养液，其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零组调零)终止培养4?h前加入MTT(5?mg/mL)，4?h后弃去培养基，每孔加入150?μL DMSO，37?℃振荡10?min，使结晶物充分融解，选择570?nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。每实验组设16个复孔，该实验完全独立重复3次。

　　1.2.6 Western blot法检测各组神经凋亡通路上凋亡蛋白的表达 培养皿培养各组细胞于药物干预24?h和72?h后, 收集细胞并用PBS洗涤3次, 加入适量的RIPA裂解液，冰浴中裂解细胞，收集蛋白，采用BCA法蛋白定量，取30?μg总蛋白上样行12%SDSPAGE电泳，然后电转移至NC膜上，5%脱脂牛奶封闭后加入相应一抗(Bcl2、Bax、细胞色素C、Caspase3、Cleaved caspase3及βactin相应多克隆抗体)于4?℃孵育过夜，用TBS缓冲液洗涤3次，每次10?min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG抗体或辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体)于室温孵育1?h，再用TBS缓冲液洗涤3次，每次10?min，加入ECL显色，以βactin?作内参照，用图像分析软件BandScan进行光密度积分值分析，该实验完全独立重复3次。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行统计分析，数据以±s表示, 采用两样本均数的student′s t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠基底前脑胆碱能神经元的形态及鉴定结果 培养的神经元在第7天神经细胞胞体呈三角形或椭圆形，体积较大且饱满，细胞周边晕光明显，细胞突起长且相互连接，见图1。 培养的神经元在第7天行胆碱乙酰转移酶(ChAT)免疫细胞化学染色，90%以上为ChAT阳性神经元，见图2。

　　2.2 细胞形态学观察 Aβ142作用于细胞24?h后各组细胞形态未见明显区别，见图3。作用72?h后形态有明显变化，随机取20个视野计数单个视野神经元数、轴突数及显微测量法测量各个神经元轴突长度，见表1。作用72?h时A组细胞胞体呈三角形或椭圆形，体积较大且饱满，细胞周边晕光明显，细胞突起长且相互连接;B组细胞突起明显减少或消失、缩短，细胞碎片增多，有的神经元内出现折光性下降，胞体变大，即将脱壁，呈死亡细胞形态。有的神经元突起发生断裂成断线状，散落于细胞周围，有的细胞胞膜已破裂，经细胞计数和显微测定发现，其突起的细胞数、神经元突起数目、长度与A组相比差异有统计学意义(P<0.001)。C组和D组神经细胞生长状态稍好，大部分仍存活，但突起很短，有较多的圆形及飘浮细胞，其突起的细胞数、神经元突起数目、长度与B组相比差异显著(P<0.05，P<0.01) 。E组细胞形态明显改善，存活的神经细胞更多，主要表现为贴壁良好，圆形及飘浮细胞减少，突起伸展，其突起的细胞数、神经元突起数目、长度与B组相比差异显著(P<0.001) ，但细胞生长状态仍不如正常对照组旺盛，见图4。 图3 药物干预24?h后各组大鼠神经元形态(×400)3表达无明显变化(P>0.05);C组、D组、E组与B组比较Bcl2表达量增加(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，Bcl2/Bax比值升高(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，其余目的蛋白未见明显变化(P>0.05)，见图5A，图5B。

　　3 讨 论

　　AD又称早老性痴呆，病理特征主要表现为中枢神经系统，尤其是大脑皮层、海马及基底前脑胆碱能系统出现大量的老年斑、神经原纤维缠结并伴随选择性的神经元丢失和死亡[4]。其中，老年斑的核心成分是39～43个氨基酸残基组成的β淀粉蛋白(Aβ), Aβ主要以2种形式存在，即Aβ140和Aβ142。Aβ142的细胞毒性尤其是Aβ142致神经元凋亡作用一直倍受研究者的关注。本研究证实聚集状态的Aβ142作用胆碱能神经元24?h后细胞形态未见明显改变，利用MTT法测定神经元OD值未见明显变化，由于570?nmOD值与神经元存活率成正比，这就表明Aβ142作用胆碱能神经元24?h后细胞存活率无明显改变，神经元未发生凋亡;作用72?h后细胞形态发生明显损伤性改变，细胞突起明显减少或消失、缩短，细胞碎片增多，呈现出死亡细胞形态，MTT法测定神经元OD值，Aβ142干预组明显低于正常对照组，这表明细胞存活率明显降低，神经元的凋亡较明显。这证实聚集状态的Aβ142对胆碱能神经元具有毒性作用，作用72?h后能明显诱导胆碱能神经元凋亡。

　　线粒体(mitochondria)是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所，有细胞“动力工厂”之称。近年来研究[5]表明，在细胞凋亡的过程中线粒体起着主要的作用。Bcl2 族的促凋亡因子Bax和Bid，主要分布于细胞质中，在凋亡刺激的作用下Bid被Caspase8水解成tBid，然后嵌入线粒体的外膜促进胞质中的Bax活化，其C末端和N末端分别展开，发生寡聚化并移至线粒体与线粒体渗透性转换孔结合形成高分子复合物，令MPTP打开使细胞色素C释放进入细胞质，继而伴有Caspases激活，从而触发Caspases级联反应导致细胞凋亡[67]。本研究证实，Aβ142作用胆碱能神经元24h时Bcl2、Bax、细胞色素C、Caspase3及Cleaved caspase3表达无明显变化，神经元也未见明显的凋亡;作用72?h后神经元凋亡明显，Bcl2表达量降低、细胞色素C、Caspase3及Cleaved caspase3的表达量增加而Bax未见明显变化。可以推测Aβ142是通过抑制Bcl2表达，激活诱导Bax的活化和向线粒体的移位而致使线粒体渗透性装换孔打开，线粒体释放细胞色素C，从而促进Caspase3及Cleaved caspase3表达与激活，触发Caspases级联反应导致细胞凋亡的。

　　MitoKATP通道是由两种不同的亚基，以1∶1的组合形成的异构八聚体。生理状态下的MitoKATP通过维持线粒体钾平衡来调控线粒体容积，使线粒体容积变化与能量代谢变化相适应[8]。有研究证实[1]利用二氮嗪预处理以激活MitoKATP通道对多种因素导致的细胞损伤与凋亡具有保护作用。Liu等[9]研究发现以250?μmol/L二氮嗪预处理1?h，能明显减轻体外培养大鼠海马神经元在缺氧复氧时的损伤。Wu等[10]证明活化MitoKATP通道可以减少离体和在体缺血再灌注神经元线粒体钙超载，抑制MPTP的通透性。环孢菌素A是线粒体渗透性转换孔开放抑制剂，可以和线粒体膜上环孢菌素A受体结合，在细胞受损伤性刺激时，抑制线粒体渗透性转换孔开放，从而抑制细胞色素C的释放，发挥抗凋亡作用。二氮嗪与环孢菌素A二者均可作用于线粒体，二者协同可能具有重要作用。 Yuliya A等[11]研究表明二氮嗪与环孢菌素A协同作用能改变MitoKATP通道和线粒体渗透性转化孔的功能状态，从而稳定ATP刺激N2A细胞引起的线粒体膜电位(ψm)的变化和减少细胞内Ca2+内流[(Ca2+)i]，改变细胞在损伤性刺激下的功能状态。本研究发现，利用环孢菌素A(20?μmol/L)干预和在Aβ142作用胆碱能神经元前1?h利用二氮嗪(500?μmol/L)预处理及二者协同干预，能明显改善Aβ142作用于胆碱能神经元72?h时的生存状态，细胞形态明显改善，存活的神经细胞增多，MTT法测定神经元OD值发现：C、D和E组均高于B组，这表明二氮嗪预处理与环孢菌素A及二者协同能提高胆碱能神经元存活率，具有拮抗Aβ142致胆碱能神经元凋亡的作用。

　　本研究证实二氮嗪与环孢菌素A及两者协同在干预Aβ142致胆碱能神经元凋亡过程中，24h后开始促进抗凋亡蛋白Bcl2的表达，作用72?h后抗凋亡蛋白Bcl2的表达量增加，细胞色素C、Caspase3及Cleaved caspase3表达量降低而细胞总蛋白Bax表达无明显变化。Liu等[12]研究证实MitoKATP通道的活化可以减少神经元缺血性损伤引起的细胞色素C的释放，诱导Bcl2表达增加，抑制Bax易位发挥抗细胞凋亡作用。Kim and Rodrigues等[1314]也发现环孢菌素A能够抑制Aβ诱导的线粒体膜渗透性转换孔的开放，抑制线粒体膜内细胞色素C等的释放，防止凋亡级联的反应，从而拮抗Aβ的细胞毒性作用。可推测二氮嗪与环孢菌素A可能是通过促进Bcl2表达抑制Bax从胞浆向线粒体移位或寡聚化，抑制PT孔开放，抑制细胞色素C从线粒体释放与表达，细胞色素C释放减少，Caspase3与Cleaved caspase3表达与激活亦减少，从而发挥抗凋亡作用的。二氮嗪与环孢菌素A两者协同也可以促进Bcl2家族抗凋亡蛋白Bcl2的表达而拮抗Aβ142致胆碱能神经元凋亡作用的，但二者是通过何种机制促进其表达有待进一步探讨。二氮嗪与环孢菌素A及二者协同可以通过线粒体途径拮抗Aβ142致神经元凋亡，这为阿尔茨海默病治疗药物的研究提供了新的靶点，对其作用机制的深入研究极具应用前景。

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