hTRXPR39融合基因cDNA克隆的构建及鉴定

　　【摘要】 目的 研究人硫氧还蛋白(hTRX)和抗菌肽PR39基因在脑缺血疾病治疗中的作用，构建hTRXPR39cDNA融合基因。方法 设计合成PR39、hTRX正向和反向引物，采用PCR方法，扩增获得两端具有BamHI和Ecor721、Eco721和EcoI酶切位点的PR39 cDNA和hTRX cDNA片段，并分别克隆到pGEMT easy中，转化细菌，筛选阳性克隆，酶切鉴定并测序。BamH I和EcoR721双酶切pGEMThTRX和pGEMTPR39，将获取的PR39/BamHI，EcoR721片段克隆到pGEMThTRX/BamHI，EcoR721载体中，构建pGEMThTRXPR39载体。结果 经DNA测序证实，修饰过的hTRX cDNA、PR39 cDNA片段的核酸序列和推导的氨基酸同数据库资料一致。重组质粒pGEMThTRXPR39酶切图谱证实hTRXPR39融合肽cDNA已克隆到pGEMT表达载体中。结论 成功克隆出具有EcoR721和EcoRI、BamH I和EcoR721酶切位点的hTRX cDNA和PR39 cDNA片段，并构建pGEMThTRXPR39载体。

　　【关键词】 脑缺血;硫氧还蛋白;基因融合;抗菌肽PR39

　　RUAN Xiyun1,　BI Jianzhong2,　LIU Qingyong1,　ZHANG Shibao3,　YANG Guangxiao4,　WANG Quanying4

　　(1. Department of Neurology ,Jinan Central Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250013, China;

　　2. Department of Neurology,Second Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250033, China;

　　3. Department of Urology, Jinan Central Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250013, China;

　　4. Xi′an Hua Guang Biological Engineering Limited Company, Xi′an 710025, China)

　　To explore the effects of hTRX and PR39 as target genes on cerebral ischemic disease, and to construct a fusion gene of hTRXPR39 cDNA. Methods The forward and reverse primers of PR39 were designed and synthesized. By means of PCR, the fragment encoding PR39 was gained, including EcoR721 and BamH I restriction enzyme sites, and the new hTRX cDNA including EcoR721 and EcoRI restriction enzyme sites was also gained. Then the synthesized fragments were easily cloned into vector pGEMT. The positive clone was identified by restriction enzymes, and then the cloned amplified fragments were sequenced by the dideoxymediated chaintermination method. The cloned hTRX and PR39 cDNA were compared with the GeneBank sequence by the DNASIS. After pGEMThTRX and pGEMTPR39 were both digested by BamH I and EcoRI, the PR39/BamHI, EcoRI was cloned into the recombinant vector pGEMThTRX/BamHI,EcoRI .The recombinant vector pGEMThTRXPR39 was gained. Results Sequences of modified hTRX and PR39 were consistent with those of the gene bank. After analyzing the ORF of the cloned hTRXPR39 cDNA by the DNASIS, we found that amino acids encoded by the cloned hTRXPR39 cDNA were identical to published results. Conclusion The sequence of hTRX including EcoR721 and EcoRI restriction enzyme sites and sequence of PR39 including EcoR721 and BamH I restriction enzyme sites were successfully obtained by PCR. Also, the recombinant vector pGEMThTRXPR39 was successfully constructed.

　　Key words： Brain ischemia; Thioredoxin;gene fusion; Antibacterial peptide PR39

　　脑缺血性疾病的基因治疗是当今的研究热点。神经营养因子、抗凋亡、促血管生成基因等已经应用于脑缺血性疾病的治疗。脑缺血损伤涉及到脑细胞的能量消耗、自由基损伤、炎症反应等多个机制，单一基因治疗很难取得满意的效果，融合基因表达可以同时将多个基因用于脑缺血性疾病的治疗。本研究利用分子生物学技术构建hTRXPR39融合基因，同时利用hTRX清除自由基、减轻炎症反应和PR39刺激血管再生等多重生物学功能，改善以往单一基因治疗脑缺血性疾病效果局限的状况。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 正负向引物(F、R、F1、R1、F2、R2)由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;pGEMT easy载体和质粒提取试剂盒购自PROMEGA公司;限制性内切酶EcoRI、EcoR721、BamHI、T4 DNA连接酶、胶回收试剂盒及溴化乙啶均购自MBI生物工程公司;DNA Marker和小牛血清白蛋白购自Gibco公司;PCR模板hTRX由西安华广生物公司构建;Taq DNA聚合酶和10?mmol/L dNTP混合液购自MBI公司;E.coli TOP10、LB培养液均由西安华广生物公司提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物的设计与合成 根据GenBank提供的hTRX基因序列，设计引物F、R，其中R加入EcoR721识别位点(CAC GTG)。根据GenBank提供的PR39基因序列，我们将序列中具有终止转录功能的TTTTT突变为TTCTT，将序列中间含有BamHI识别位点的AGGATTCCA序列突变为CGCATTCCA，且各自编码的氨基酸未改变;同时在PR39两端分别加入EcoR721识别位点(CAC GTG)、BamH I识别位点(GGA TCC)，设计引物F1、R1、F2、R2.

　　F：5'GCACGTGGACTAATTCATTAATGGTGG　3';R：5'GGGGTCGGGGGACGTCTCCTCACGTGGACTAATTCATTAATGG　3';F1：3'CCACGTGAGGAGACGTCCCCGACCCCCATATTTGCC 5';F2：5'CCATATTTGCCAAGGCCAAGGCCACCTCCGTTCTTCCCACCAAGGCTCCCAC

　　C3';R1：3'CCGTGGTGGGAACCTTGGTGGGAACCCTGGTGGAATGCGTGGTGGGAGCC　5';R2：5'CGGATCCTCAGGGGAACCGTGGTGGGAACC 3'.

　　1.2.2 hTRX cDNA序列的克隆和鉴定 应用PCR扩增获得具有Eco721和EcoI酶切位点的hTRX cDNA片段。首先，在0.5?mL无菌Eppdorf(Ep)管内，建立PCR体系：加入正向引物F、反向引物R、模板hTRX各1?μL、10×扩增缓冲液10?μL，dNTP(10?mmol/L) 2?μL，Mgcl2溶液6?μL及消毒去离子水78?μL，石蜡油50?μL封闭反应体系，置94?℃水浴中预变性5?min后，再加入Taq DNA聚合酶1?μL 进行PCR循环，即94?℃变性1?min，60?℃退火1?min，72?℃延伸1?min，30个循环后，再于72?℃延伸5?min;取5?μL的PCR产物经10?g/L琼脂糖凝胶电泳后，用溴化乙啶染色，在短波紫外分析仪下观察和投射紫外线分析仪下照相。

　　1.2.3 PCR产物的纯化 回收的PCR产物按常规方法抽提所得cDNA。使用等量酚氯仿抽提一次后，加入1/10体积的3?mol/L乙酸钠后，加入2倍体积无水乙醇，颠倒混匀后-20?℃沉淀2?h，9677×g,离心10?min，使用500?μL 70%乙醇洗涤沉淀1次，在恒温箱中干燥，加入25?μL pH 8.0的TE缓冲液保存。

　　1.2.4 PR39cDNA序列的克隆和鉴定 先后两次应用互为引物模板PCR方法扩增获得具有Eco721和BamH I酶切位点的PR39 cDNA片段。第1次PCR法扩增：在0.5?mL无菌Eppdorf(Ep)管内，加入正向引物F2、反向引物R1各1?μL、10×扩增缓冲液10?μL，(10?mmol/L) dNTP(10?mmol/L)2?μL，Mgcl2溶液6?μL及消毒去离子水79?μL，石蜡油50?μL封闭反应体系，置94?℃水浴中预变性5?min后，再加入Taq DNA聚合酶1?μL进行PCR循环，即94?℃变性1?min，50?℃退火1?min，72?℃延伸1?min，30个循环后，再于72?℃延伸5?min;第2次PCR法扩增：在0.5?mL的无菌Ep管内，加入正向引物F1、反向引物R2、第1次PCR产物各1?μL，10×扩增缓冲液10?μL，dNTP(10?mmol/L)2?μL，Mgcl2溶液6?μL及消毒去离子水78?μL，石蜡油50?μL封闭反应体系，置94?℃水浴中预变性5?min后，再加入Taq DNA聚合酶1?μL进行PCR循环，即94?℃变性1?min，50?℃退火1?min，72?℃延伸1?min，30个循环后，再于72?℃延伸5?min;取5?μL?的PCR产物经10?g/L琼脂糖凝胶电泳后，用溴化乙啶染色，在短波紫外分析仪下观察和投射紫外线分析仪下照相。回收的PCR产物的纯化同1.2.3。

　　1.2.5 重组质粒pGEMThTRX和pGEMTPR39的构建 建立反应体系：① 载体pGEMT easy 0.5?μL，hTRX PCR产物3?μL，10×Buffer 2.5?μL，双蒸水18?μL，连接酶1?μL;②载体pGEMT easy 0.5?μL，PR39 PCR产物3?μL，10×Buffer 2.5?μL，双蒸水18?μL，连接酶1?μL;将抽提和纯化的hTRX和PR39片段分别和载体pGEM Teasy用T4 DNA连接酶连接，22?℃连接过夜。用CaCl2转化法转化感受态E.coli TOP10，将重组质粒DNA导入E.coli TOP10。将已转化的感受态细菌均匀涂布于含氨苄青霉素的琼脂平板表面，于37?℃培养16?h，筛选阳性菌落。

　　1.2.6 阳性克隆的鉴定及序列分析 挑取白色菌落，至液体LB培养基摇床过夜，4?℃冰箱保存。采用碱裂解法小量制备质粒DNA，分别经EcoRI酶切后，进行10?g/L琼脂糖凝胶电泳，用短波紫外线分析仪观察结果并照相。

　　1.2.7 重组表达质粒pGEMThTRXPR39的构建及鉴定 碱裂解法大量制备实验室已经构建的pGEMThTRX和pGEMTPR39载体质粒，见图1。用EcoR721和BamHI酶切pGEMThTRX和pGEMTPR39，分别建立酶切反应体系：①pGEMThTRX 10?μL，EcoR721 3?μL，BamHI 1.5?μL，10×Buffer 5?μL，双蒸水31?μL;②pGEMTPR39 10?μL，EcoR721 3?μL，BamHI 1.5?μL，10×Buffer 5?μL，双蒸水31?μL。37?℃水浴过夜。用1%琼脂糖凝胶电泳法分别回收所需基因片段。用T4 DNA连接酶将用EcoR721和BamHI酶切

　　获得的PR39目的基因片段与pGEMThTRX连接。建立连接反应体系：pGEMThTRX酶切片断(胶回收大片)1?μL，pGEMTPR39(胶回收小片)1?μL，10×Buffer 2.5?μL，双蒸水19.5?μL，连接酶1?μL;用T4 DNA连接酶将带有黏性末段的质粒pGEMThTRX与目的基因片段PR39cDNA连接过夜。按上述1.2.5?中的方法制备并纯化质粒pGEMThTRXPR39cDNA，用EcoRI酶切后,电泳分析并照相。从电泳凝胶中回收目的基因片段。将上述纯化质粒送上海生物技术公司测序。将选择的阳性菌株增殖培养，大量制备质粒DNA，于-20?℃保存备用。

　　2 结 果

　　2.1 克隆基因hTRX的酶谱分析 经10?g/L琼脂糖凝胶电泳显示，所得PCR产物hTRX的大小约321?bp，见图2。

　　2.2 克隆基因PR39的酶谱分析 经10?g/L琼脂糖凝胶电泳显示，所得PCR产物PR39的大小约117?bp，见图3。

　　2.3 重组载体pGEMThTRX的内切酶谱分析 以其转化感受态E.Coli TOP10后， 将转化菌接种于含氨苄青霉素的琼脂平板上进行培养。挑取单个菌落，以碱裂解法提取质粒DNA后，用EcoRI酶切切去3?015?bp 的载体片段和321?bp的目的基因片段，表明hTRX片断插入到pGEMT easy载体中，见图4。

　　2.4 融合基因pGEMThTRXPR39cDNA的内切酶谱分析 以其转化感受态E.Coli TOP10后， 将转化菌接种于含氨苄青霉素的琼脂平板上进行培养。挑取单个菌落，以碱裂解法提取质粒DNA后，用EcoR I和BamH I酶切切去3?015?bp的载体片段和438?bp的目的基因片段，表明hTRXPR39片断插入到pGEMT easy载体中，见图6。

　　3 讨 论

　　脑缺血疾病的基因治疗中积累了一定的经验，但绝大多数尚局限于单一目的基因治疗，如神经营养因子基因用于神经元的保护、抗凋亡基因减少神经元的凋亡、血管生成基因的促血管生成作用等，而造成脑缺血损伤的原因是多方面的，如果同时应用两个或多个目的基因，从不同角度阻断脑缺血损伤的机制会得到更好的治疗效果。

　　本研究设计并构建hTRXPR39融合基因，进一步将其应用于脑缺血疾病的治疗。hTRX是一种具有氧化还原活性的小分子蛋白质，基因全长13?kb，开放阅读框架编码104个氨基酸[12]。已有研究证实hTRX可以直接和间接清除自由基，也可以通过调节核因子、丝裂原活化激酶MAPK等减轻炎症反应[1]，而且hTRX本身也能作为应激诱导蛋白起到保护神经细胞的作用[3]。PR39是含有39个氨基酸的短肽，富含脯氨酸和精氨酸，被誉为血管生成的总开关。它可以通过阻断蛋白酶体对HIF1α的降解使HIF1α保持在相对高的浓度[45]，提高VEGF、KDR、FLT1、FGFR1等促血管生成基因的表达[6]，与生理状态下体内缺氧启动的血管新生机制极为相似。Wu等[7]已证实PR39在血管内皮细胞缺氧时作为抗缺氧应激凋亡因子抑制血管内皮细胞的凋亡。本研究通过hTRXPR39融合基因的治疗，以期从清除自由基、减轻炎症反应、减少血管内皮细胞凋亡和诱导血管再生减少梗死面积等多个方面起到治疗作用，改善以往单一目的基因治疗效果局限的状况。

　　在hTRX和PR39cDNA的连接方面，本研究应用简捷经济的PCR方法对hTRX和PR39进行改造。在设计中去除hTRX 3′端终止密码并加入EcoR721识别位点(CAC GTG)。在PR39 5′端加入EcoR721 识别位点(CAC GTG)，3′端加入BamH I识别位点(GGA TCC)。加入的识别位点不仅保证hTRX和PR39cDNA的准确连接，而且为后续的融合基因连入载体奠定了基础。

　　当然，在融合hTRX和PR39各自生物功能的同时，本研究也考虑到了二者结构上的特性。PR39属于短肽，作为目的基因单独存在时极不稳定，容易发生折叠导致构象的改变。如果将其用作治疗目的，必须将它作为重组蛋白体进行转运。hTRX恰恰为PR39提供了一个交架结构，为PR39更好的成为治疗活性的适配子提供有力的位点[8]。由于hTRX是天然的人体蛋白，免疫原性低，用它作为交架蛋白构建基因融合表达系统，可显著的增加表达产物的可溶性和活化表达蛋白的活性。适配子PR39插入交架结构hTRX后比自由肽稳定，更容易被送进细胞内，保证PR39功能的发挥，而hTRX本身结构和功能不受影响。因此，二者在结构上的相容性保证各自功能的发挥。

　　虽然嵌合肽的基因表达应用于临床治疗尚处于实验阶段，但越来越多的研究证实了该技术的可行性。本研究不仅对脑缺血疾病的靶向治疗，而且对于通过融合基因实现蛋白质和肽类物质的临床应用具有重大的临床意义，为下一步构建可分泌表达hTRXPR39的重组腺伴病毒，进行体内外脑缺血动物模型实验奠定了良好的基础。

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