利用RNAi技术抑制Bcl2基因表达增强肺腺癌A549细胞放射敏感性

　　【摘要】 目的 利用RNAi技术抑制Bcl2基因的表达，观察其对肺腺癌A549细胞凋亡和放射敏感性变化的影响。方法 构建Bcl2基因的干扰质粒pBcl2siRNA，稳定转染人肺腺癌A549细胞，同时设立转染无意义链组、空载体组和未转染组。采用Real time RTPCR和Western blot方法, 观察Bcl2基因在mRNA和蛋白水平表达的变化。采用流式细胞术和克隆形成方法,检测RNA干扰对A549细胞放射敏感性的影响。结果 成功构建bcl2 siRNA质粒，转染A549细胞，获得稳定转染细胞株A549/Bcl2Ins;Bcl2mRNA、 Bcl2蛋白表达明显降低;A549/Bcl2Ins凋亡率[(10.11±0.92)%]明显高于对照组，6Gy X线照射后凋亡率[(28.81±1.10)%]明显高于对照组及未照射组;A549/Bcl2Ins的D0和Dq值分别为1.399和1.298，明显低于转染无意义序列细胞株A549/Bcl2Neg(1.695和2.480)、转染空载体细胞株A549/SD (1.706和2.227)和空白对照细胞A549(1.816和2.777)。结论 RNAi技术可以有效抑制肺腺癌A549细胞Bcl2基因的表达，增强A549细胞对X线的放射敏感性。

　　【关键词】 肺肿瘤; 基因;细胞凋亡; 辐射耐受性; RNA干扰

　　GAO Hui, LIU Fang, MA Daoxin, CHENG Yufeng

　　(Cancer Center, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China)

　　To explore the influence of Bcl2 gene expression by RNAi on the radiosensitivity of human lung adenocarcinoma cell line A549. Methods Vectors containing SiRNA targeting Bcl2 gene were constructed and transfected into A549. Real time RTPCR and Western blot were used to compare the efficiency of gene silencing. Flow cytometry was used to determine the effects of pBcl2siRNA and radiation on apoptosis. D0 and Dq of four cell lines were calculated by Clone formation array, and radiosensitivity of A549/Bcl2Ins was evaluated also by Clone formation array. Results Three stable transfected cell lines A549/Bcl2Ins, A549/ Bcl2Neg and A549/SD were screened from the transfected A549 cells. Western blot analysis and real time RTPCR indicated that expression of Bcl2 was suppressed by pBcl2siRNA. The apoptosis rate of A549/Bcl2Ins was higher than that of the controls, and the apoptosis rate of A549/Bcl2Ins at 6Gy irradiation was higher than that of the controls and the unirradiated groups. D0 and Dq of A549/Bcl2Ins were 1.399 and 1.298, respectively, lower than those of A549/ Bcl2Neg(1.695 and 2.480) or those of A549/SD(1.706 and 2.227) or those of A549(1.816 and 2.777). Conclusion RNAi could inhibit Bcl2 gene expression and enhances radiosensitivity of A549 cells.

　　Key words: Lung neoplasms; Genes; Apoptosis; Radiation tolerance; RNA interference

　　Bcl2基因家族是重要的抗细胞凋亡基因，在维持细胞的生理分化、发育和数量的动态平衡中具有重要作用。Bcl2基因的过度表达能抑制多种凋亡因素诱导的细胞凋亡，延长细胞存活时间，在一定程度上影响着肿瘤的发生、发展，并促使肿瘤细胞对传统的放疗和化疗过程表现出广泛的抵抗性[1]。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近几年发展起来的一项特异性基因沉默的方法。为探讨Bcl2在肺癌发生、发展中的作用以及评价siRNA介导的基因治疗技术，本研究设计合成了抑制Bcl2的siRNA重组质粒，并将其转染至人肺腺癌细胞株A549细胞，以观察特异性抑制Bcl2基因对A549细胞生长、凋亡及放射敏感性的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 pRNAU6.3/Hygro载体购自Genscript公司，含绿色荧光蛋白基因;BamH I、Hind III、T4 DNA连接酶由美国MBI公司提供;质粒抽提试剂盒购自天根公司;肺腺癌细胞株A549由齐鲁医院血研室保存;潮霉素系Calbiochem公司产品;LipofectamineTM2000系Invitrogen公司产品;RTPCR试剂盒购自TaKaRa公司;Realtime PCR Master Mix(SYBR Green)购自东洋纺公司;Annexin V试剂盒、小鼠抗人βActin单抗、山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记二抗购自晶美公司;小鼠抗人Bcl2单克隆抗体系SantaCruz公司产品;直线加速器购自Siemens公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 pBcl2siRNA重组质粒的构建与鉴定 利用Genscript 公司siRNA在线设计软件，获得针对Bcl2基因siRNA特异序列Bcl2空质粒pRNAU6.3/Hygro经BamHI和HindIII酶切后，与上述合成的DNA片段用T4DNA连接酶连接，转化成功后挑选阳性克隆，扩增并提取质粒，进行测序鉴定，将构建出的重组质粒分别命名为pBcl2siRNA和pNegsiRNA。

　　1.2.2 细胞转染与稳定筛选 A549细胞培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，在37?℃、5%CO2孵箱中培养至对数生长期，常规接种于24孔板，每孔密度为2.0×105个细胞，约80%～90%汇合后，经LipofectamineTM2000介导重组质粒转染A549细胞, 转染后24?h传代，48?h后加入冲击量为200?μg/mL的潮霉素，筛选阳性克隆，2周后改为100?μg/mL，继续培养至肉眼可见克隆。荧光显微镜下标记含有绿色荧光蛋白的克隆，将其挑出后置于培养瓶中传代培养。将转染pBcl2siRNA、pNegsiRNA、pRNAU6.3/Hygro的A549细胞株分别命名为A549/Bcl2Ins、A549/ Bcl2Neg和A549/SD。

　　1.2.3 Real time RTPCR检测Bcl2 mRNA表达 TRIzol提取转染及未转染A549细胞的总mRNA(按说明书步骤进行)，然后逆转录成cDNA，进行目的序列Bcl2和内参GAPDH的Real timePCR的扩增。Bcl2和GAPDH的引物由北京博尚生物公司合成，引物序列及Real timePCR的条件为Bcl2上游引物:5'TTGGCCCCCGTTGCTT3'，下游引物:5'CGGTTATCGTACCCCGTTCTC3'，扩增片段长度为65?bp，退火温度60?℃，循环50次;GAPDH上游引物:5'GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3'，下游引物:5'GAAGA

　　TGGTGATGG GATTTC3'，扩增片段长度为207?bp，退火温度60?℃，循环50次。

　　1.2.4 Western blot检测Bcl2蛋白表达 细胞裂解液裂解A549转染及未转染细胞，以考马斯亮蓝G250染料法测定蛋白质浓度。10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1.5?h，然后将蛋白质转移到固相支持体(NC膜)，用含脱脂奶粉的TBST封闭2h后分别加入小鼠抗人Bcl2单抗和βActin单抗。4?℃温育过夜，TBST漂洗5min 3次，加山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记二抗，温育1?h，DAB显色90?s后，X光片曝光，重复3次。

　　1.2.5 X射线照射及流式细胞仪检测细胞凋亡率 将转染及未转染A549细胞各分为2组，1组接受直线加速器6?Gy X线照射，照射后培养24?h;另1组未接受X线照射，作为对照组。各组细胞胰酶消化后以PBS洗涤2次，重悬在100?μL AnnexinV结合缓冲液中，以PBS调整细胞浓度为1×106/mL，然后加入AnnexinV/FITC 5?μL、PI 10?μL，混匀后于室温避光孵育15?min。以BD公司FAcs Calibur流式细胞仪检测各组细胞，用WinMDI29软件分析凋亡率，每组细胞重复检测3次。

　　1.2.6 克隆形成实验 将对数生长期的A549转染及未转染细胞消化成单细胞悬液后，以100、500、500、2?000、2?000个细胞分别接种于60?mm培养皿中，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液4?mL，37?℃、5%CO2培养8～10?h，待细胞贴壁后，按由低到高的细胞密度分别接受0、2、4、6、8?Gy X线照射，每组细胞的每个照射剂量点设3个平行样本。照射后继续培养14?d，PBS洗涤，甲醇固定后Giemsa染色，计数大于50个细胞的克隆数。实验重复3次，单击多靶模型应用SPSS11.5拟合细胞存活曲线，得出D0(细胞的平均致死剂量)和Dq(准阈剂量)值。

　　1.3 统计学处理 测定结果用SPSS11.0统计软件分析，数据以±s表示，多样本均数采用方差分析，组间采用SNKq检验。P<0.05为有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 pBcl2siRNA重组质粒的构建及转染结果 合成的Bcl2siRNA片段酶切后，用T4DNA连接酶成功构建入pRNAU6.3/Hygro，测序鉴定插入序列正确，分别命名为pBcl2siRNA和pNegsiRNA;质粒转染A549后，筛选获得阳性克隆，荧光显微镜下可见成克隆的发绿色荧光的A549/Bcl2Ins细胞，细胞呈梭形，证明转染成功,见图1。

　　Clone of A549/Bcl2Ins transfected with pBcl2siRNA(×200)

　　2.2 Bcl2 mRNA表达情况 Real time RTPCR结果显示，A549/Bcl2Ins的mRNA表达水平[(0.036?4±0.061?6)%]明显低于A549/ Bcl2Neg组[(2.22±1.09)%]、A549/SD组[(2.80±0.91)%]及A549组[(2.18±1.03)%](P<0.05);A549/ Bcl2Neg、A549/SD?和A549之间相互比较(P>0.05),结果表明构建的pBcl2siRNA真核表达质粒能有效抑制A549细胞Bcl2的表达，而空载体和无意义序列质粒对Bcl2的mRNA转录水平无明显的抑制作用, 见图2。

　　2.3 Bcl2蛋白表达情况 Western blot法检测结果表明，A549/ Bcl2Neg、A549/SD、A549的Bcl2蛋白表达水平差异不显著(P>0.05), A549/Bcl2Ins细胞的Bcl2蛋白水平与其余3组差异有统计学意义(P<0.05)。 Western blot法检测结果证明构建的pBcl2siRNA真核表达质粒能显著抑制A549细胞Bcl2基因的蛋白表达水平，而空载体和无意义序列质粒无明显的抑制作用,见图3。 图2 A549细胞经不同质粒转染后Bcl2 mRNA水平

　　2.4 细胞凋亡率检测结果 流式细胞仪检测各组细胞于X射线照射前、后的凋亡率,结果见表1。X射线照射前，A549细胞凋亡率仅为(5.60±0.45)%，与A549/Bcl2Neg和A549/SD组凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)，A549/Bcl2Ins的凋亡率(10.11±0.92)%明显增加(P<0.05)。X射线照射后A549/Bcl2Ins的细胞凋亡率高达(28.81±1.10)%，与其余3组细胞照射后相比,差异有统计学意义(P<0.05);同时与未照射的A549/Bcl2Ins细胞相比，凋亡率也有明显升高 (P<0.05)。细胞凋亡率检测结果表明，pBcl2siRNA能够促进A549细胞凋亡的发生率，同时提高细胞对放射线的敏感性。

　　2.5 克隆形成实验结果 克隆形成实验结果显示，A549与A549/SD和A549/Bcl2Neg的D0值和Dq值相似，而A549/Bcl2Ins的D0值(1.399)和Dq值(1.298)与其余3组细胞相比均明显降低(P<0.05), 见表2。同时存活曲线显示A549/Bcl2Ins较其他3者明显左移,见图4。说明A549/Bcl2Ins的放射敏感性显著增高。

　　3 讨 论

　　Bcl2是一种抗凋亡基因[2]，可以降低肿瘤细胞对放疗或化疗的敏感性。最近的研究表明Bcl2蛋白高表达于肺癌等实体肿瘤中[3]，具有抑制肿瘤细胞凋亡的作用。因此，有效抑制Bcl2蛋白在肺癌细胞内的表达，是提高肺癌细胞的放化疗敏感性、改善临床疗效的可能途径。

　　已有何冬梅等[4]利用反义寡核苷酸抑制Bcl2蛋白在肺癌细胞内的表达,从而增加肺癌细胞放射敏感性.但反义寡核苷酸很容易降解,只能起一过性的瞬时作用. 而RNAi技术可以克服这一缺点。RNAi，是指将外源性或内源性双链RNA(doublestranded RNA, dsRNA)导入细胞后引起与该段RNA同源的mRNA产生特异性降解，其相应的基因表达受到抑制。RNAi技术有高效率、可以向子代遗传等优点，还可同时对多个目标基因进行研究[5]。Kappler[6]和Coma[7]用RNAi技术干扰survivin基因在肿瘤中的表达，发现其既能使肿瘤细胞凋亡，又能抑制肿瘤血管的生成。而本研究构建出能表达Bcl2siRNA的质粒, 并稳定转染Bcl2表达阳性的A549细胞，筛选出克隆进行研究后发现:转染了阴性对照质粒的A549细胞与正常的A549细胞在Bcl2表达的抑制和对X线的反应方面差异均无显著性,说明该质粒可以安全有效的应用。

　　本研究观察RNAi对A549细胞内Bcl2表达及细胞凋亡和放射线敏感性的影响。Real time RTCR结果显示，Bcl2的mRNA表达下调;Western blot检测结果表明，A549肺腺癌细胞中Bcl2蛋白的表达明显受到抑制。流式细胞仪检测细胞凋亡情况表明，经转染pBcl2siRNA后，A549细胞对于放射线的敏感性有明显的提高，其细胞凋亡率显著高于转染无意义链和空载体的对照组细胞。克隆形成实验表明：pBcl2siRNA组细胞的D0值为1.399，明显小于其他3组对照细胞，而同1种细胞D0值的改变标志着细胞对放射线敏感性的变化，D0值越小，说明细胞对射线的抵抗能力越低;Dq值表示细胞亚致死损伤修复能力的大小，Dq值越小，表明细胞对亚致死损伤修复能力越弱。pBcl2siRNA组细胞的Dq值为1.298，明显小于其余3组细胞的Dq值，提示pBcl2siRNA转染后能更有效地抑制A549细胞亚致死性损伤修复，这也可能是其放射增敏作用的原因之一。本研究结果证实，Bcl2是肿瘤基因治疗中重要的靶基因，而siRNA Bcl2则能显著抑制Bcl2介导的抗凋亡效应，促进肺腺癌细胞的凋亡。

　　本研究应用RNAi技术抑制Bcl2的表达，为肺癌的基因治疗研究提供了一些实验基础和理论依据，但仍存在许多问题，如：在人体内RNAi是否与在体外以及动物模型中有相似的研究结果?肺癌细胞是否会对RNAi介导的特异性mRNA快速降解或产生抵抗性等。这些问题需要我们在以后的研究工作中进一步论证和改善。

　　【参考文献】

　　[1] Huang Z. Bcl2 family proteins as targets for anticancer drug design[J]. Oncogene, 2000, 19(56):66276631.

　　[2] Nemec K N, Khaled A R. Therapeutic Modulation of Apoptosis: Targeting the BCL2 Family at the Interface of the Mitochondrial Membrane[J]. Yonsei Med J, 2008, 49(5):689697.

　　[3] 〖ZK(#]Daniel J C, Smythe W R. The role of Bcl2 family members in nonsmall cell lung cancer[J]. Semin Thorac Cardiovasc Surg, 2004, 16(1):1927.

　　[4] 何冬梅,张洹. Bcl2反义寡核苷酸增强NCI2H460细胞对紫杉特尔和放射线的敏感性[J]. 第二军医大学学报,2005,26(5):674677.

　　[5] Pushparaj P N, Aarthi J J, Manikandan J, et al. siRNA, miRNA and shRNA: In vivo applications[J]. J Dent Res, 2008, 87(11):9921003.

　　[6] Kappler M, Bache M, Barrel F, et al. Knockdown of survivin expression by small interfering RNA reduces the clonogenic survival of human sarcoma cell lines independently of human sarcoma cell lines independently of p53[J]. Cancer Gene Ther, 2004, 11(3):186193.

　　[7] Coma S, Noe V, Lavarino C, et al. Use of siRNAs and antisense oligonucleotides against survivin RNA to inhibit[J]. Oncololgy, 2005, 25(4):761763.