白细胞介素17抗体对哮喘小鼠中性粒细胞的影响

　　【摘要】 目的 观察白细胞介素17(IL17)抗体对哮喘小鼠中性粒细胞(PMN)的影响。方法 随机将40只雄性昆明小鼠分为对照组(A组)、哮喘组(B组)、IL17抗体组(C组)、地塞米松组(D组) ，每组10只，采用卵蛋白致敏和激发方法建立哮喘模型并给予相应治疗，对血PMN分离纯化检测凋亡率;采用支气管肺泡灌洗液(BALF) 进行细胞分类计数，肺组织病理切片HE染色观察炎性细胞浸润;采用免疫组化法检测中性粒细胞髓过氧化物酶(MPO)表达水平。结果 C组外周血PMN凋亡率明显高于B组，BALF中Neu计数及肺组织免疫组化MPO阳性细胞数明显低于B组;D组外周血PMN凋亡率及BALF中Neu计数与B组差异无统计学意义，肺组织免疫组化MPO阳性细胞数明显高于B组。结论 IL17抗体有利于缓解哮喘小鼠PMN引起的炎症反应。

　　【关键词】 哮喘;白细胞介素17; 中性白细胞;小鼠

　　LI Wei, YE Qian, GAO Shuncui, LI Daowei, JIANG Shujuan, ZHU Ling

　　(Department of Respiratory, Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, China)

　　To investigate the effects of IL17 neutralization antibody on polymorphnuclear (PMN) of asthma mice. Methods A total of 40 Kunming mice were randomly divided into four groups： the control group (group A)， the asthma group (group B)， the IL17 neutralization antibody group (group C), and the Dex group (group D).Mice were sensitized and challenged with ovalbumin(OVA) to establish asthma models, and groups C and D were injected with the IL17 neutralization antibody and Dex respectively. Peripheral blood PMN was isolated and purified to observe the apoptosis percentage. The total cell number and differentiation cell number were counted in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) . The pathological characters of lung tissues were observed using HE staining. Myeloperoxidase (MPO) expression was detected by immunohistochemical technique. Results Percentage of the PMN apoptosis in group C was significantly higher than that in group B, while the number of Neu in BALF and MPO level in lung tissues were significantly decreased. Compared with group B, the percentage of PMN apoptosis and number of Neu in BALF in group C had no significant differences, while levels of MPO were significantly increased. Conclusion IL17 neutralization antibody may inhibit asthmatic airway inflammation caused by PMN.

　　Key words: Asthma; Interleukin17; Neutrophils; Mice

　　支气管哮喘是由多种炎症细胞和炎症组分参与的慢性气道炎症。嗜酸性粒细胞(eosinophile granulocyte，EOS)浸润是其中心环节。中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils，PMN)在哮喘发病机制中也起重要作用，尤其表现在突发致命性哮喘、哮喘持续状态及糖皮质激素治疗无效的哮喘[1]。白细胞介素17(IL17)即细胞毒性T细胞抗原8(cytotoxic T lymphocyte associated antigen 8,CTLA8)，可显著加重气道内PMN募集、活化而加重急性哮喘和慢性哮喘急性发作[2]。糖皮质激素是目前控制哮喘的主要药物，但部分患者不敏感。本研究通过复制小鼠慢性哮喘模型,探讨IL17抗体对哮喘PMN的影响,并与地塞米松(dexamethasone，Dex)进行比较。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 雄性昆明小鼠40只, 18～22?g， 由山东大学实验动物中心提供; 卵蛋白(OVA， Ⅱ级)、 小鼠IL17抗体、 AnnexinV凋亡试剂盒购自深圳晶美公司; 髓过氧化物酶(MPO)免疫组化试剂盒购自美国Neomarkers公司; Dex系齐鲁制药厂生产(批号： 国药准字H37021343); 小鼠中性粒细胞分离液、 小鼠淋巴细胞分离液系天津灏洋生物有限公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 模型的建立 雄性昆明小鼠40只适应性饲养1周后，随机分为对照组(A组)、哮喘组(B组)、IL17抗体组(C组)、Dex组(D组)，每组10只。参照文献[3]，建立慢性哮喘模型。抗原致敏阶段：第1～13天隔天腹腔注射0.002%OVA混悬液0.5?mL，共7次;雾化激发阶段：第33～40天将小鼠放入自制雾化吸入箱,每天雾化吸入1%OVA 溶液30?min, 连续8?d。C组和D组分别在雾化激发前30?min腹腔注射IL17抗体20?μg和Dex 1?mg/kg。A组致敏和激发均以生理盐水替代OVA。

　　1.2.2 血PMN的分离纯化 末次激发后24?h,小鼠摘眼球取血0.8～1.0?mL，肝素抗凝，与Hank液1∶1?混匀后，小心加于2?mL的小鼠中性粒细胞分离液面上，450×g,离心15?min，收集界面上和细胞分离液中的细胞，加于含Hank液4.5?mL的试管中，充分混匀，450×g,离心10?min，沉淀洗2次制成2?mL细胞悬液，加于2?mL的小鼠淋巴细胞分离液面上，450×g,离心15?min，弃去界面上的淋巴细胞，所剩即为小鼠PMN。瑞氏染色示PMN 纯度>85%,台盼蓝染色查细胞活力>88%，见图1。

　　1.2.3 支气管肺泡灌洗液(BALF)收集 小鼠眼球取血处死后，结扎右肺门根部，气管插管，1?mL生理盐水缓慢注入肺内，并轻轻按摩肺组织30?S，缓慢回抽，反复3次，回收BALF约0.8?mL,450×g,离心10?min。弃上清液，沉淀用0.8?mL Hank液重悬，取0.1?mL?于血细胞计数板测定细胞总数,取0.2?mL涂片，瑞氏染色，至少计数200个白细胞进行细胞分类计数。

　　Isolated and purified PMN of the peripheral blood in mice (Giemsa′s，×1?000)

　　1.2.4 肺组织标本制备 取右肺上叶，10%中性福尔马林固定24?h，石蜡包埋切片, HE染色观察炎性细胞浸润，免疫组织化学法测中性粒细胞髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)表达水平。

　　1.2.5 流式细胞仪测PMN凋亡率 将分离的PMN悬于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，调整细胞浓度为2×106/mL，置于37?℃，5%CO2培养箱中培养，24?h后取100?μL，先后与FITC标记的Annexin Ⅴ及碘化丙啶(PI)溶液孵育(具体方法参照试剂盒说明书)，采用流式细胞仪检测，至少计数5?000个细胞。

　　1.2.6 免疫组化染色 操作按说明书进行，主要包括常规脱蜡，抗原修复, 3%H2O2灭活内源性过氧化物酶,血清封闭，滴加一抗、二抗及链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物,DAB显色、复染、封片。用PBS代替一抗做阴性对照。每张肺组织切片随机选择5个支气管腔,在高倍光镜下计数胞浆阳性的细胞总数,取其平均值为该片的代表值[4]。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS11.0软件进行统计分析，数据以±s表示，多组间比较采用F检验(单因素方差分析)，组间两两比较采用q检验,P<0.05?为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 症状观察 B组小鼠激发后出现烦躁不安、易惊、抓耳挠腮、呼吸加深加快，然后弓背、前肢缩短、俯伏不动、腹肌痉挛、扣唇紫绀、毛色失去光泽等阳性反映，哮喘模型建立成功。C组及D组上述表现明显减轻。A组激发过程中未出现上述表现。

　　2.2 外周血PMN凋亡 AnnexinV-PI-、AnnexinV+PI-、AnnexinV+PI+分别为活细胞、凋亡细胞、坏死细胞。B组小鼠PMN凋亡率明显低于A组(P<0.01);C组明显高于B组(P<0.01);D组与B组比较凋亡率有所减少(P>0.05)，见表1，图2。可见哮喘小鼠外周血PMN凋亡较对照组延迟，IL17抗体可促进哮?喘小鼠PMN的凋亡，而Dex进一步抑制其凋亡。

　　只数PMN凋亡率(%)A组1055.47±5.71B组1043.75±3.99*C组1053.41±4.80△D组1039.11±5.38* *P<0.01 vs A组;△P<0.01 vs B组图2 各组小鼠外周血PMN凋亡率(AnnexinⅤPI)

　　2.3 肺组织病理学观察 B组小鼠肺组织外观体积增大，表面肿胀，有不规则暗红色充血区。切面有白色泡沫状渗出物，并可见明显的血管断面。显微镜观察，B组支气管及血管周围大量炎症细胞浸润,如PMN、L、Eos,支气管腔狭窄，有时可见粘液栓堵塞, 气道上皮细胞排列不齐，局部上皮肿胀脱落,平滑肌明显增厚,粘膜广泛水肿，肺泡隔水肿、增厚，肺泡腔融合扩大;A组支气管及肺泡结构正常, 支气管粘膜上皮完整, 无闭塞,未见或见极少炎症细胞; C组及D组炎症细胞浸润较B组显著减少，但部分结构仍有变化，见图3。图3 各组小鼠肺组织炎性浸润程度(HE×200)

　　2.4 MPO免疫组织化学法检测结果 阳性细胞的胞浆呈棕黄色表达,其细胞主要是PMN。支气管壁周围MPO呈阳性表达的细胞数B组显著高于A组(P<0.01),C组显著低于B组(P<0.01)，D组显著高于B组(P<0.01)，见表3，图4。血管壁周围，B组及D组可见密集阳性表达的炎症细胞，而A组及C组则较少表达，见图5。

　　3 讨 论

　　IL17是由Yao等[5]于1995年发现的细胞因子,人体内IL17主要由外周血CD4+ T 细胞产生 ，为同源二聚体蛋白,包括23个氨基酸,相对分子质量15～23?kU。小鼠体内IL17的唯一来源是αβTCR+ CD4-CD8-细胞[6]。鼠与人IL17显示了60%～70%的同源性。哺乳动物的IL17都有一个高度保守的位点,提示了种内交叉反应的可能性。

　　近年发现，PMN也是哮喘气道炎症中重要的效应细胞，尤其表现在急性发作期和重症哮喘。PMN可产生氧自由基、IL8和弹性蛋白酶(NE)等，使气道反应性增高，炎性细胞浸润，气道分泌增加，并使转化生长因子(TGFα)增加导致气道重构。

　　IL17是哮喘发病相关细胞因子网络的重要成员之一,其机制与IL17趋化并活化气道内PMN，促使其释放相关的细胞因子及酶等有关[7]。IL17作为一种炎前因子,对PMN强大的化学趋化作用是间接的。实验证明，IL17作用于分离的鼠PMN并不能增加标志PMN的髓过氧化物酶(MPO)的活性,说明IL17缺乏对PMN的直接化学趋化作用[8]，其中间介质目前所知为IL6、IL8。这两种因子是由支气管上皮细胞和成纤维细胞经IL17的作用而释放的[9]。IL17通过诱导CXC 释放及IL8合成增加而实现对PMN的作用,这一过程可以被TNFα所增强。另外, IL17 还通过内源性速激肽的释放起作用,这一作用通过神经激肽1(N K1)受体实现的。

　　MPO是PMN的一种特异性含氯溶酶体酶，主要存在于PMN嗜天青颗粒中,含量较恒定,约占细胞干重的5%,其含量的多少与PMN的数目成正比,是其积聚的指标, 在有卤素离子存在时,能清除PMN吞噬过程中释放的H2O2产生次氯酸(HClO)。HClO可氯化氨基基团,造成肽链断裂,形成小分子胺,破坏许多生物分子及细胞膜, 损害机体防卫系统， 同时可激活基质金属蛋白酶(MMPs),影响气道重构。

　　本研究显示，经IL17抗体干预的小鼠症状较哮喘组明显减轻，外周血PMN凋亡率明显增高，BALF中PMN计数明显减少，肺组织免疫组化MPO明显减少，表明IL17抗体对哮喘中炎症细胞PMN的消除有明显促进作用。IL17能与TNFα一起诱导滑膜成纤维细胞产生粒-巨核细胞集落刺激因子(GMCSF)[10]，GMCSF可增加黏附分子在PMN上表达，使PMN易于招募，提高其对趋化因子的敏感性，并抑制其凋亡延长寿命[11]。IL17抗体可能基于这种机制，抑制GMCSF的产生，促进哮喘小鼠PMN的凋亡。该组BALF中Eos计数较哮喘组无明显改善，可能与IL17抗体促进支气管内IL5生成有关，但Eos的增多并未加重小鼠的气道高反应性，可能与其活性降低有关[3]。

　　经Dex干预的小鼠,BALF中Eos计数明显减少，PMN计数无明显变化，外周血PMN凋亡率与哮喘组差异无统计学意义，肺组织免疫组化MPO明显增多，说明Dex不利于缓解PMN引起的炎症反应。糖皮质激素对PMN的凋亡具有异质性，即在促进Eos、Lym等炎性细胞凋亡的同时，却抑制了PMN的凋亡[12]。

　　有研究[3]提出,哮喘可能存在着不同的表型,如以Eos 浸润为主的气道炎症性哮喘和以PMN 浸润为主的气道炎症性哮喘[13]。激素对前者效果较好，而对后者效果不理想。故临床中对糖皮质激素治疗不敏感的患者，不能一味的增加激素的剂量来增加疗效。激素的不适当应用会引起真菌感染，也会加重哮喘的症状。如能针对不同的表型采取针对性的措施可能会取得更好的疗效。

　　IL17作为一种炎症介质，在哮喘气道炎性反应中对PMN起化学趋化作用,这一理论的深入研究,将有助于为PMN参与的哮喘发作提供新的药物。

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