PDGFC及其变体PDGFCb在肾透明细胞癌中的表达调节及意义

　　【摘要】 目的 探讨血小板源性生长因子C(PDGFC)及其变体血小板源性生长因子Cb(PDGFCb)在肾透明细胞癌与相应的正常组织中的表达调节及其意义。方法 采用RTPCR方法检测12例原发性肾透明细胞癌及相对应的正常肾组织中的PDGFC，并探讨PDGFC和PDGFC变体表达的关系。观察顺铂对肾癌细胞株PDGFC和PDGFCb mRNA表达的调节作用。结果 与其对应的正常组织相比较，12例肾癌组织中，9例PDGFCb mRNA 表达水平降低，10例全长PDGFC mRNA 表达明显上调，PDGFC/Cb的比值有11例明显上升。在mRNA水平，顺铂对PDGFC 及PDGFCb呈下调作用，对PDGFCb的下调作用呈剂量依赖性。PDGFC的这两种剪切变体在肾癌组织及与其相应的正常肾组织中表达差异有统计学意义(P<0.05)，且全长PDGFC的表达显著升高。结论 PDGFCb反向调节PDGFC的分泌，对PDGFC表达调节作用可能与肾细胞癌的致癌性相关。顺铂对肾癌细胞株PDGFC和PDGFCb mRNA表达的调节作用为肾癌的致癌机理研究提供了可能的途径。

　　【关键词】 肾肿瘤; 顺铂; 血小板源性生长因子C

　　LIU Juanping1, LIU Zhaoxu1，2, XU Zhonghua2, LIU Cheng2, ZHOU Zunlin2, YAN Lei2, FAN Yidong2

　　(1. School of Nursing，Shandong University, Jinan 250012， China;

　　2. Department of Urology, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012， China)

　　To explore expressions of Plateletderived growth factor C(PDGFC) and a novel spliced variant (designated as PDGFCb) of human PDGFC in clear cell renal cell carcinoma and to explore its significance. Methods Using semiquantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR) method, expressions of PDGFC and PDGFCb in 12 clear cell renal cell carcinoma tissues and matched adjacent normal tissues were determined. The relationship between expressions of PDGFC and PDGFCb and the impact of Cisplatin on mRNA expression of PDGFC and PDGFCb in the renal cell line was analyzed. Results Compared with the matched normal tissues, 9 of the 12 samples had a decreased PDGFCb mRNA expression, 10 had an increased PDGFC expression, and 11 had an increased PDGFC/Cb expression. On the mRNA level, Cisplatin downregulated expressions of PDGFC and PDGFCb and the effect on the latter was dosedependently. Expressions of PDGFC and PDGFCb between the carcinoma tissues and the matched normal tissues were significantly different and expression of PDGFC was upregulated in the carcinoma tissues. Conclusion PDGFCb presents a reverse regulation on the secretion of PDGFC, and this might be involved in RCC tumorigenesis. The downregulation of PDGFC and Cb induced by Cisplatin provides a potential pathway for research of the tumorigenesis of renal cell carcinoma.

　　Key words： Kindey neoplasms; Cisplatin; Plateletderived growth factorC

　　血小板源性生长因子(plateletderived growth factor，PDGF)最早鉴定于人血小板，对结缔组织细胞具有促有丝分裂作用，参与许多发育和生理作用，其在肿瘤的发生发展中的作用也越来越受到重视[1]。PDGF家族包括PDGFA、 B、 C和D， 该家族大部分成员都具有选择性转录作用[2]。为更好地认识这些生长因子的作用，了解其生物学特性，研究其剪切变体的特性非常重要。本研究应用RTPCR法研究血小板源性生长因子C(plateletderived growth factorC，PDGFC)的变体在肾透明细胞癌中的表达，并探讨其对PDGFC表达的反向调节作用，以了解PDGFC及其变体在肾透明细胞癌中的作用及其可能的生物学意义。

　　1 资料与方法

　　1.1 组织标本 收集2004年～2005年山东大学齐鲁医院泌尿外科因原发性肾透明细胞癌手术切除的肿瘤标本12例， 男6例， 女6例， 28～69岁， 平均55.6岁。全部组织取自术前未经任何治疗的手术切除并经病理证实的标本， 并选取与肿瘤相应的正常肾组织标本作对照。术前取得所有患者的知情同意。手术切除后20?min内转至-80?℃低温冰箱保存备用。肿瘤大小4.5～15.5?cm， 平均8.0?cm， 按照Robson分级： Ⅰ级6例， Ⅱ级3例， Ⅲ级2例， Ⅳ级1例。

　　1.2 肾癌细胞株培养 肾癌细胞株A498、TK10、Caki2和KRC/Y均购自美国ATCC公司。在37?℃ 5%CO2的条件下培养, 培养基为含5%胎牛血清的RPMI1640。每周更换培养基2次，传代1次。对上述细胞株分别使用顺铂(购自BioVision 公司，药品批号：15501000)50μmol 和100?μmol处理，8?h后收获细胞。相关试剂均购自Invitrogen公司。

　　1.3 引物设计 通过EST信息库筛选人PDGFC mRNA，发现人PDGFC的原始基因结构中的内显子中包含一个额外的61?bp大小的外显子，为验证这种新的剪切变体，根据GeneBank 进入号NM016205，设计的上游引物PDGF-cf2位于一号外显子，序列如下：5′GCT TCC ACC CCA GTG CAG CCT TCC3′。下游引物PDGF-c2r1位于2号外显子，序列如下：5′CTG CTA CTA ATC TCC ATA CCA AGA CC3′。

　　1.4 RTPCR检测肾组织及处理后的肾癌细胞株中PDGFC和PDGFCb的表达 收获经顺铂处理的肾癌细胞株，取低温保存的组织标本，采用Trizol试剂提总RNA。于核酸蛋白测定仪上测定浓度后，取3?μg总RNA经MMLV逆转录酶逆转录成cDNA，进行PCR扩增。PCR扩增参数：94?℃变性30?s，55?℃退火40?s，72?℃延伸60?s，循环35次。βactin循环28次。等量RTPCR产物于3%的琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，UV下成像，用凝胶成像分析软件计算出PDGFC和PDGFCb与相应的βactin产物条带的光密度值之比(%)作为最终的光密度值。

　　1.5 统计学处理 采用SPSS 11.5软件，用配对t检验评价PDGFC/PDGFCb在肾组织中mRNA表达水平，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 PDGFC及PDGFCb mRNA在肾透明细胞癌组织中的表达 与其对应的正常组织相比，在12例肾癌组织中，有9例(75%)呈现PDGFCb mRNA 表达水平降低，有10例(83%)肿瘤组织呈现全长PDGFC mRNA表达明显上调(t=-3.588，P<0.05)，见表1、图1，PDGFC/Cb的比值(PDGFC与PDGFCb光密度值之比)有11例(92%)明显上升(t=-2.880，P<0.05)，见表1。

　　2.2 顺铂对肾癌细胞株PDGFC及PDGFCb的调节作用 见图2。在mRNA水平，不同浓度的顺铂(0，50，100?μmol)对肾癌细胞株A498，TK10, Caki2和 KRC/Y处理8?h后，其对PDGFC 及PDGFCb的表达均呈现下调作用，尤其是对PDGFCb的下调作用呈现出剂量依赖性趋势。

　　3 讨 论

　　全长PDGFC是一个双域生长因子，包含N末端的CUB和C末端的GFD域。其合成和分泌是通过一种潜在的二聚物生长因子，从CUB域释放生长因子域限制蛋白质水解来激活。所以在PDGFC中的CUB域的重要作用之一即是阻止全长的蛋白结合到相应的受体[23]。所以蛋白水解无活性的全长PDGFCC在控制有活性的PDGFCC的生物利用中起着重要的作用。

　　在VEGF家族中，如人VEGFB，PIGF基因和鼠VEGFD都存在拼接异构体，在本实验室鉴定出的PDGFC的变体PDGFCb也具有调节全长PDGFC的分泌的作用。选择性的剪切变体的存在是PDGF/VEGF家族的多样性和复杂性的共同机制。在我们的研究中发现PDGFCb的出现位于细胞浆内，但是仍然终止于内质网，通过与全长PDGFC共同作用，抑制PDGFC蛋白的分泌[4]。这在PDGF家族中是一种较为奇特的PDGFC生物利用调节机制。

　　PDGFC的活性生物利用有两种途径来调节：①通过控制细胞外空间和体液发生的蛋白裂解PDGFCC，②通过与位于细胞内的PDGFCb形成异源性双聚物。另外，无论PDGFC的CUB域是否能够调节生长因子,其与细胞外或细胞周围基质的因素之间的关系仍然需要进一步研究。

　　本研究结果表明在原发性肾透明细胞癌中PDGFC和PDGFCb的表达均与其对应的正常肾组织具有明显差异，与其对应的正常组织相比，肿瘤中PDGFCb mRNA 表达水平降低，全长PDGFC mRNA 表达明显上调(P<0.05)，PDGFC/Cb的比值明显上升(P<0.05)，一般而言，PDGFCb降低，PDGFC就出现升高，结果PDGFC/Cb的比值在癌组织中明显升高，该结果与PDGFCb对全长PDGFC在细胞外空间的生物利用的抑制作用相一致。通过上述第二条途径，PDGFCb与PDGFC形成异源性双聚物，保留在细胞内逐渐被降解[4]，从而抑制其向细胞外分泌，进而对其生物效应起到抑制作用。在本研究中，前者表达降低，对后者的抑制作用减弱，从而后者的表达增高。提示PDGFCb对PDGFC的分泌具有反向调节作用。有报道PDGFRα与肿瘤进展相关，在晚期肿瘤中的表达水平明显高于早期肿瘤，而与PDGFA水平无关[5]。PDGFCC/PDGFRα的功能性回路作用能够通过自泌或旁泌机制对肾透明细胞癌的进展产生影响。本研究中发现在肿瘤中PDGFC变体PDGFCb的表达降低，其抑制作用减弱，使PDGFC的表达增加，从而可能增强PDGFCC/PDGFRα功能性回路对肾透明细胞癌的进展的影响。PDGFC变体PDGFCb的下调表达可能对肾透明细胞癌的致癌产生影响。

　　顺铂类化疗药物目前已应用于多种肿瘤的治疗，但由于严重的胃肠道反应和肾毒性使其应用受到限制。顺铂化疗的作用机制目前一般认为是通过与核DNA结合，干扰正常的转录过程及DNA复制而诱发的细胞毒性作用实现的。但其确切的作用途径尚不清楚。DNA分子结构的改变引起细胞DNA损伤识别和修复[6]，由此导致细胞继续存活，从而产生耐药性。尽管仍需要相应的变化，与相对应的正常组织细胞相比，肿瘤细胞具有内在的DNA修复机制的差异性。VHL抑癌基因是在1993年确定的[7]，其等位基因的突变在肾透明细胞癌的发病过程中有重要作用。VHL 基因失活是公认的肾癌发生发展的重要遗传学因素, 但其拟遗传学异常并非其主要机制[8]。另外，抑癌基因启动子高度甲基化被认为是除突变和缺失以外的抑癌基因功能失活的关键机制[8]。本研究观察了顺铂对肾肿瘤细胞中PDGFC及其变体PDGFCb在mRNA水平的调节，PDGFC与对其有抑制作用的PDGFCb表达都下调，且后者呈剂量依赖性，提示在mRNA水平研究肾细胞癌的致癌机理可能是一条有意义的途径。

　　综上所述，PDGF和VEGF以及其转录调节因子HIF1在肾癌的血管生成过程中起着重要作用。研究发现顺铂能够通过不同的机制抑制HIF1，从而抑制乏氧诱导的VEGF的表达[9]。然而对PDGF的调节机制目前尚不清楚。本研究仅仅观察了顺铂对PDGFC/Cb在转录水平的下调作用，对于其作用机制还需要进一步研究。

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