人miRNA let7a2质粒的构建及其表达

　　【摘要】 目的 构建人miRNA let7a2真核表达质粒，检测其在肺癌细胞A549中的表达。方法 以人肺腺癌A549细胞总RNA为模板，将RTPCR扩增let7a2的前体(prelet7a2)序列, 克隆至pSilencer4.1CMV neo表达载体中，构建pSilencer4.1let7a2重组质粒，转染A549细胞,采用RTPCR法检测prelet7a2的表达;构建let7a2靶序列-报道基因融合质粒pMIRReportlet7a2T，与pSilencer4.1let7a2质粒共转染A549细胞，测定相对荧光素酶活性,以检测成熟let7a2在A549细胞中的表达及作用;采用MTT比色法检测pSilencer4.1let7a2转染对A549细胞增殖的影响。结果 构建的人let7a2真核表达质粒pSilencer4.1let7a2和let7a2靶序列-报道基因融合质粒pMIRReportlet7a2T经酶切及测序鉴定正确;pSilencer4.1let7a2质粒转染A549细胞后，RTPCR检测prelet7a2表达较对照组明显增强;MTT比色法显示let7a2对A549细胞增殖有抑制作用。pSilencer4.1let7a2 质粒和pMIRReportlet7a2T质粒共转染A549细胞后，通过报告基因检测相对荧光素酶活性较对照组降低，显示let7a2表达质粒转染A549细胞后，可有效表达let7a2并转变为成熟的具有生物学活性的let7a2。 结论 成功构建了人let7a2真核表达质粒,并在肺腺癌细胞A549中有效表达。

　　【关键词】 肺肿瘤; 基因表达调控; miRNA;let7a2

　　plasmid of microRNA let7a2 in lung cancer cells

　　GUAN Hengyun1, ZHANG Ju1, ZHANG Pengju1, CHEN Weiwen1,　 LIU Wenwen2,

　　YU Chunxiao3, HU Xiaoyan1, JIANG Anli1

　　(1. Institute of Biochemistry and Molecular Biology, School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, China;

　　2. Department of OtolaryngologyHead and Neck Surgery, Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, China;

　　3. Department of Endocrinology, Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, China)

　　To construct a recombinant eukaryotic expression plasmid of microRNA let7a2 and express it in lung cancer A549 cells. Methods let7a2 precursor sequence was amplified by RTPCR using RNA from A549 cells and was cloned into the pSilencer4.1 CMV neoexpression vector to produce the recombinant pSilencer4.1let7a2. Then the recombinant pSilencer4.1let7a2 was transfected into lung cancer A549 cells, and the prelet7a2 expression was verified by RTPCR. According to the miRBase Targets database, the target sequence of let7a2 was synthesized and inserted to the pMIRReport luciferase reporter vector to construct pMIRReportlet7a2T, which was cotransfected with pSilencer4.1let7a2 into A549 cells, and the relative luciferase activity was detected. The effect of let7a2 on A549 cell proliferation was tested by MTT. Results The results of DNA sequencing showed that sequences of pMIRReportlet7a2T and pSilencer5.1let7a2 were correct. RTPCR prelet7a2 was overexpressed in A549 cells after transfection of pSilencer4.1let7a2. Cotransfection of pSilencer4.1let7a2 and pMIRReportlet7a2T showed that mature let7a2 had biological activity. MTT results indicated that let7a2 inhibited proliferation of the transfected A549 cells. Conclusion The eukaryotic expression plasmid of let7a2 was successfully constructed and effectively expressed in A549 cells.

　　Key words: Lung neoplasms; Gene expression regulation; miRNA; Let7a2 新近研究发现[12]，miRNA在人类的多种疾病，包括肿瘤的病理过程中都发挥重要作用。 miRNA既可作为抑癌基因下调原癌基因活性,也可作为癌基因下调抑癌基因活性，还可调节肿瘤相关基因的表达,其自身突变、缺失、易位及相互调控异常，还可导致相关基因异常表达。对miRNA的深入研究可探索肿瘤发生发展的分子机制，并可为肿瘤的临床诊断与治疗提供新的靶点。let7 miRNA是最早被发现的miRNAs之一,最近的研究[3]已经证明在肺癌中其表达低水平。 Takamizawa等[4]发现肺癌患者的let7表达显著降低，并且导致患者更差的预后，非小细胞肺癌患者的let7表达水平越低，其预后越差，术后生存期越短。体外组织培养实验表明，在人的肺癌细胞中瞬时的表达let7可以抑制细胞的增殖，这也说明let7在肺组织中可能是一个抑癌基因。本研究通过构建let7a2的真核表达载体，转染肺癌细胞，以RTPCR方法检测let7a2在A549细胞中的表达情况，为进一步研究let7a2在肺癌中的生物学功能奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 pSilencerTM4.1CMV neo载体、pSilencerTM4.1CMV neo Negative Control载体、pMIRREPORTTM Luciferase载体、pMIRREPORTTM βgal Control载体购自Ambion公司; URIzol试剂、质粒抽提试剂盒由Invitrogen公司提供; 限制性内切酶、T4DNA连接酶、Taq酶、PCR试剂盒系大连宝生物工程公司生产;MMLV 逆转录酶试剂盒购自Promega公司;大肠杆菌JM109由本室保存，肺腺癌细胞株A549购自中科院上海细胞所; F12K培养基，新生牛血清购于Gibco公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 PCR扩增 prelet7a2基因 根据prelet7a2基因序列设计引物,上游引物：let7a2F 5′CCCGGATCCCATTGTGACTGCATGCTCC3′;下游引物：let7a2R 5′CCCAAGCTTGTTGTTTAGTGCAAGACCC3′用TRIzol一步法提取人肺腺癌细胞A549总RNA，用随机6聚体引物和MMLV逆转录酶将细胞总RNA逆转录为cDNA, 以cDNA为模板, 以let7a2F和let7a2R为引物，PCR扩增prelet7a2基因。 PCR条件: 94?℃ 2?min，94?℃ 30?s，60?℃ 30?s，72?℃ 20?s，35个循环, 最后72?℃ 10?min。

　　1.2.2 let7a2表达质粒pSilencer4.1let7a2的构建 RTPCR产物经凝胶电泳分离, 凝胶回收试剂盒回收目的片段，用BamH　Ⅰ和Hind Ⅲ酶切回收片段， 与pSilencerTM4.1CMV neo载体连接构成pSilencer4.1let7a2表达质粒，限制性酶酶切及测序鉴定阳性重组体。

　　1.2.3 let7a2靶序列-报道基因融合质粒的构建 构建let7a2靶序列-报道基因融合质粒与let7a2表达质粒共转染细胞，通过报告基因检测pSilencer4.1let7a2质粒的表达及其作用。根据miRBase Targets数据库，查找haslet7a2靶序列(UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU)，人工合成其DNA序列及其互补序列，两端分别加Hind Ⅲ和Sac Ⅰ酶切位点。7a2TF: 5′AGCTTTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT

　　GAGCT 3′; 7a2TR: 3′ AACTCCATCATCCAACATATC

　　AAC 5′。等摩尔比混合两条链，95?℃加热5?min，自然冷却至室温。将退火双链克隆至pMIRReportTM Luciferase载体中构成let7a2靶序列-报道基因融合质粒pMIRReportlet7a2T。限制性酶酶切及测序鉴定阳性重组体。

　　1.2.4 细胞培养及转染实验 为检测pSilencer4.1let7a2质粒的表达，肺癌A549细胞接种于25?mL培养瓶, 用含10%小牛血清、100?U/mL青霉素及100?U/mL链霉素的F12K培养基，37 ?℃、5% CO2条件下培养。当细胞融合度>80%时，换用2?mL无抗生素F12K培养基， 用FuGENE HD转染细胞，每瓶8?μL FuGENE HD+2?μg pSilencer4.1let7a2质粒+100?μL OptiMEM。对照组转染等剂量pSilencerTM4.1CMV neo Negative Control载体。

　　为检测pSilencer4.1let7a2质粒的表达及其对靶序列的作用，肺癌A549细胞接种于24孔板中，用含10%小牛血清、100?U/mL青霉素及100?U/mL链霉素的F12K培养基，37?℃、5% CO2条件下培养至80%～90%融合度，换用无抗生素F12K培养基(0.5?mL/孔)，用FuGENE HD转染细胞(4复孔)，每孔1?μL FuGENE HD+0.2?μg pSilencer4.1let7a2+0.3?μg pMIRReportlet7a2T+0.03?μg pMIRReport βgal Control+25?μL OptiMEM。对照组转染等剂量 pSilencerTM4.1CMV neo Negative Control载体或pMIRReportTM Luciferase 空载体。

　　1.2.5 RTPCR检测let7a2在肺癌A549细胞中的表达 肺癌A549细胞在转染pSilencer4.1let7a2 质粒48?h后, 用TRIzol一步法提取细胞总RNA，用随机6聚体引物和MMLV逆转录酶将细胞总RNA逆转录为cDNA, 以cDNA为模板, PCR扩增prelet7a2片段。PCR引物为: F 5′CATTGTGACTGCATGCTCC 3′，R 5′GTTGTTTAGTGCAAGACCC 3′。内参照5SRNAF 5′TACGGCCATACCACCCTGAA 3′, 5SRNAR 5′TAACCAGGCCCGACCCTGCT3′,PCR反应条件同前, 1.5%琼脂糖电泳检测PCR产物，凝胶成像系统采集图像。

　　1.2.6 荧光素酶活性测定 按试剂盒(Promega)说明书操作，弃掉细胞培养基，PBS冲洗细胞1次，加入1×RLB裂解液，放置室温10?min后，吹打细胞，收集细胞裂解液。荧光素酶活性测定：荧光测定管中加100?μL LAR II(luciferase assay reagent)，再加细胞裂解液20?μL，放置发光仪中，测定pMIRREPORT(tm)中的firefly荧光素酶活性，读数为M1。β半乳糖苷酶活性测定：30?μL细胞裂解液+20?μL 1×RLB裂解液+50?μL 2×AB检测缓冲液，37?℃保温30?min，加150?μL 1?mol/L碳酸钠终止反应，420?nm检测，计算得到的β半乳糖苷酶活性为M2。用M1/M2比值表示相对荧光素酶活性。

　　1.2.7 MTT比色法检测细胞增殖 取生长状态良好的细胞, 等密度接种于24孔板中, 培养至大于80%融合度时，按上述方法转染细胞，每孔1?μL FuGENE HD+0.5?μg pSilencer4.1let7a2质粒+25?μL OptiMEM。对照组转染等剂量 pSilencerTM4.1CMV neo Negative Control载体。转染12?h后，用1?mL培养基悬浮细胞，稀释5倍后接种于96孔板(6复孔)，培养24～48?h后, 每孔加入10?μL MTT(5?mg/mL),继续培养4?h。弃上清液,每孔二甲亚枫100?μL脱色，于570?nm检测吸光度。

　　2 结 果

　　2.1 let7a2表达质粒pSilencer4.1let7a2的酶切鉴定及测序 RTPCR扩增prelet7a2产物经纯化，克隆至pSilencer4.1CMV neo载体，构成重组质粒pSilencer4.1let7a2，经限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切后，电泳显示：得到2个片段，分别为112?bp的prelet7a2和4?944?bp的线性pSilencer4.1CMV neo载体，见图1。结果与理论值相符。pSilencer4.1let7a2测序结果：CATTGTGACTGCATGCTCCCAGGTTGAGGT

　　AGTAGGTTGTATAGTTTAGAATTACATCAAGGGAGAT

　　AACTGTACAGCCTCCTAGCTTTCCTTGGGTCTTGCAC

　　TAAACAAC，其结果与Genebank中序列完全一致。

　　pSilencer4.1let7a2重组质粒的酶切电泳鉴定

　　1：pSilencer4.1let7a2经BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切得到112?bp和4?944?bp的片段

　　2：DNA分子量标准

　　Fig.1 Electrophoresis of pSilencer4.1let7a2 recombinant digested by restriction enzymes

　　1: pSilencer4.1let7a2 recombinant digested by BamHⅠand Hind Ⅲ, generating prelet7a2 (112?bp) and linear pSilencer4.1 CMV neo vector (4?944?bp)

　　2: DNA marker

　　2.2 let7a2靶序列-报道基因融合质粒酶切鉴定及测序 根据haslet7a2靶序列, 人工合成其DNA序列及其互补序列，两端分别加Hind Ⅲ和Sac Ⅰ酶切位点,克隆到pMIRReportTM Luciferase载体中构成let7a2靶序列-报道基因融合质粒pMIRReportlet7a2T，经Mlu Ⅰ酶切鉴定，电泳分析显示：重组质粒pMIRReportlet7a2T不能被Mlu Ⅰ开环;对照空质粒pMIRReportTM Luciferase可被Mlu Ⅰ开环，得到6?470?bp大小的片段, 结果与理论值相符合，见图2。pMIRReportlet7a2T测序结果正确(测序结果略)。

　　2.3 let7a2表达质粒在肺癌A549细胞中的表达 pSilencer4.1let7a2瞬时转染肺腺癌A549细胞, 对照组转染等剂量 pSilencerTM4.1CMV neo Negative Control载体。48 ?h后, 用TRIzol一步法提取细胞总RNA，RTPCR扩增prelet7a2片段。内参为5SRNA。电泳结果显示：pSilencer4.1let7a2质粒在A549细胞中表达明显增强，A549细胞本身有一定量的prelet7a2表达，见图3。pMIRReportlet7a2T重组质粒酶切电泳鉴定

　　1：DNA分子量标准

　　2：pMIRReportTM Luciferase载体经Mlu Ⅰ酶切得到6?470?bp?片段

　　3：pMIRReportlet7a2T重组质粒不能被Mlu Ⅰ切开

　　Fig.2 Electrophoresis of pMIRReportlet7a2T recombinant digested by restriction enzymes

　　1: DNA marker

　　2: pMIRReportTM Luciferase vector digested by Mlu Ⅰ, generating a linear pMIRReportTM Luciferase vector (6?470?bp)

　　3: pMIRReportlet7a2T recombinant digested by Mlu Ⅰ

　　RTPCR检测prelet7a2在A549细胞中的表达

　　1：DNA分子量标准

　　2：转染pSilencerTM4.1CMV neo Negative Control载体后，prelet7a2在A549中的表达

　　3：转染pSilencer4.1let7a2重组质粒后，prelet7a2表达增强。

　　Fig.3 Electrophoresis of prelet7a2 amplified by RTPCR

　　1: DNA marker

　　2: prelet7a2 in A549 cells transfected with pSilencerTM4.1CMV neo negative control vector

　　3: prelet7a2 in A549 cells transfected with pSilencer4.1let7a2 plasmid

　　2.4 let7a2表达质粒对let7a2靶序列的作用 pSilencer4.1let7a2质粒和pMIRReportlet7a2T质粒共转染A549细胞，对照组转染等剂量pMIRReportTM Luciferase 空载体。测定pMIRREPORT(tm)中的firefly荧光素酶活性M1和β半乳糖苷酶活性M2, 计算M1/M2比值表示相对荧光素酶活性。结果显示：pSilencer4.1let7a2 和pMIRReportlet7a2T共转染组较对照组pSilencer Negative Congtrol和pMIRReportlet7a2T共转染组其相对荧光素酶活性明显降低。转染等剂量 pMIRReportTM Luciferase 空质粒的对照组，荧光素酶活性无明显变化，见图4。

　　A549细胞中let7a2相对荧光素酶活性

　　A:pSilencer4.1let7a2 和pMIRReportlet7a2T共转染

　　B:pSilencer Negative Congtrol和pMIRReportlet7a2T共转染

　　C:pSilencer4.1let7a2和pMIRReportTM Luciferase vector共转染

　　D:pSilencer Negative Congtrol和pMIRReportTM Luciferase vector共转染

　　Fig.4 Measurement of relative luciferase activity of let7a2 in A549 cells

　　There are four cotransfected group：

　　A: pSilencer4.1let7a2 and pMIRReport

　　let7a2T cotransfected

　　B: pSilencer Negative Congtrol and pMIRReportlet7a2T cotransfected

　　C: pSilencer4.1let7a2 and pMIRReportTM Luciferase vector cotransfected

　　D: pSilencer Negative Congtrol and pMIRReportTM Luciferase vector cotransfected

　　2.5 let7a2表达质粒对肺癌A549细胞增殖的影响 A549细胞转染 pSilencer4.1let7a2 质粒，对照组转染等剂量 pSilencerTM4.1CMV neo Negative Control。分别于24、48?h后，用MTT比色法于570?nm检测吸光度。结果显示：转染pSilencer4.1let7a2组较对照组转染pSilencerTM4.1CMV neo Negative Control的活细胞数明显减少，分别减少12%(24?h)和15%(48?h)，见图5。

　　3 讨 论

　　肺癌是世界上导致死亡的主要肿瘤之一，其A549细胞转染pSilencer4.1let7a2重组质粒或者pSilencerTM4.1CMV neo Negative Control载体后，24、48?h细胞活性。

　　Fig.5 After transfected with pSilencer4.1let7a2 (blank bars) or pSilencerTM4.1CMV neo Negative Control (grey bars), A549 cell alivaty in 24 to 48 ?h

　　病因主要是遗传性因素和吸烟导致的。最近的研究显示：人类的许多疾病，像肠癌，慢性淋巴细胞白血病和脆性X综合征等与miRNA有密切关系[59]。在许多肿瘤中，miRNA的表达有显著的改变，由此可作为一种疾病诊断的工具[10]。let7 miRNA家族被认为在肿瘤抑制中发挥作用，研究发现在非小细胞肺癌(NSCLC)中let7 家族呈现低表达[11]。

　　let7最早在线虫中发现，存在于多种物种中，具有许多同源序列统称为let7家族，它们大多定位于9、l1、22号染色体上。let7a2是这个家族的成员之一，其基因定位于染色体11q24.1。成熟的人类 let7a2分子具有22?bp，其前体序列具有72?bp。Johnson等[12]报道肺癌组织let7miRNA减少，RAS蛋白增加，RAS基因的3′UTR区包含有多个与let7互补的位点，因此，RAS基因可能是let7调控的靶基因之一，let7通过抑制RAS蛋白的表达进而抑制肿瘤细胞恶性生长。

　　miRNA的生成具有一个由细胞核到细胞质的过程。首先，在细胞核中miRNA基因转录成初级产物(primiRNA)，这个初级转录产物被RNase Ⅲ Drosha切割成为具有发夹结构约70～90?bp大小的单链RNA前体 (premiRNA)，它需要在转运蛋白exportin5的作用下由核内转到胞质中[13]。在细胞质中，premiRNA被RNase Ⅲ Dicer进一步切割产生成熟的miRNA，通过与其靶mRNA分子的3′端非编码区域(3′untranslated region, 3′UTR)互补匹配导致该mRNA分子的降解或者蛋白翻译的抑制[14]，来调控基因表达，产生基因沉默。

　　本研究以人肺腺癌细胞A549总RNA为模板，根据prelet7a2基因序列设计引物,采用RTPCR方法,扩增其前体序列prelet7a2并将其插入到pSilencer4.1CMV neo表达载体中，经BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切及DNA测序确定其序列完全正确后，重组体转染A549细胞, RTPCR在mRNA水平检测let7a2的表达情况，根据miRBase Targets数据库，查找haslet7a2靶序列，人工合成其DNA序列，构建报告基因融合质粒pMIRReportlet7a2T，经Mlu　Ⅰ酶切鉴定及DNA 测序正确后，与pSilencer4.1let7a2共转染A549细胞，在报告基因表达水平检测成熟let7a2 在细胞中的形成及作用;最后用MTT比色法检测let7a2对A549细胞增殖的影响。

　　为表明构建的let7a2表达载体在肺癌细胞中的表达情况，本研究从3个方面来验证：① 用RTPCR方法检测prelet7a2的表达情况; ② 用报告基因方法检测成熟let7a2对其靶序列的作用;③ 用MTT比色法检测let7a2对细胞生长的作用。通过此3方面的检测，本研究结果表明：构建的真核表达载体pSilencer4.1let7a2可在肺癌细胞A549中有效表达，表明通过它们转染细胞可用于其功能研究。此结果为今后进一步研究haslet7a2在肺癌发生发展中的作用提供了实验基础。

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