人巨细胞病毒对兔平滑肌细胞LOX1表达的影响

　　【摘要】 目的 了解人巨细胞病毒(HCMV)感染对兔平滑肌细胞(SMC)凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体1(LOX1)表达的影响，探讨HCMV在动脉粥样硬化(AS)发生发展中的可能作用机制。方法 采用RTPCR、Western blotting等技术检测HCMV ADl69株感染的兔SMC中LOX1的表达。结果 HCMV感染兔SMC后,LOX1表达明显升高(P<0.01)。结论 HCMV可引起兔SMC中LOX1的表达上调，这可能是HCMV参与AS的机制之一。

　　【关键词】 巨细胞病毒;受体, 脂蛋白;平滑肌细胞

　　rabbit smooth vascular muscle cells

　　LEI Xueming1,　LI Shuying1,　DONG Bo2,　PENG Ying1,　TANG Wei1, QI Mei1,

　　LIU Juan1,　SUN Yundong1,　YU Han1,　ZHOU Yabin1

　　(1. Department of Microbiology, School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, China;

　　2. Department of Cardiology, Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, China)

　　To investigate the effect of human cytomegalovirus(HCMV) infection on expression of lectinlike oxidized lowdensity lipoprotein receptor1 in rabbit smooth vascular muscle cells, and to show its role in the formation of atherosclerosis (AS). Methods Expression of LOX1 in rabbit smooth vascular muscle cells which were affected by HCMV ADl69 was analyzed by reverse transcriptionpolymerase chain reaction and Western blotting. Results HCMV infection upregulated the expression of LOX1 in rabbit smooth vascular muscle cells. Conclusion HCMV infection upregulates the expression of LOX1 and this may be one of the mechanisms by which Human cytomegalovirus is involved in atherosclerosis.

　　Key words: Cytomegalovirus; Receptors, Lipoprotein; Smooth muscle cell 人类巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)抗原及其DNA序列存在于动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的病灶组织,主要见于血管平滑肌细胞(vascular smoothmusclecells,VSMC)和血管内皮细胞。而VSMC作为动脉中膜唯一类型的细胞，是AS病变的重要组成部分[1]。凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体1(lectinlike oxidized low density lipoprotein receptor1，LOX1)是一种新型的氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，OXLDL)受体[2]。LOX1结合OXLDL后，可通过激活细胞外信号调节激酶(extracellular signalregulated kinase，ERK)诱导血管平滑肌细胞向内膜迁移，并促进平滑肌细胞增殖和增加脂质摄入[3]，引起血管病理改变，最终导致AS等血管性疾病的发生[4]。

　　目前HCMV感染[5]与LOX1的表达在AS发生机制中的相互作用尚不明确。因此，研究病毒感染后VSMC的脂蛋白受体表达、脂质代谢的变化，对阐明动脉粥样斑块的形成有重要意义。本研究通过检测HCMV感染兔VSMC后LOX1的表达情况，探讨HCMV，LOX1，AS三者之间的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞与试剂 人胚肺成纤维细胞(human embryonic lung fibroblast, HELF)为本实验室原代培养;兔平滑肌细胞为原代培养;人巨细胞病毒AD169标准株由本室保存，将HCMV AD169标准株接种于已经融合单层的HELF进行增殖;平滑肌细胞培养采用刚出生雄兔的主动脉平滑肌细胞培养方法,鉴定采用免疫酶染方法检测肌动蛋白(兔抗人肌动蛋白单克隆抗体);RTPCR引物由上海生物工程技术服务有限公司合成;LOX1一抗购自Santa Cruz Biotechnology公司;二抗体购自上海捷瑞生物工程有限公司。

　　1.2 实验分组 正常细胞对照组：用含10%血清的培养基培养VSMC细胞;HCMV感染组：以100TCID50?0.1?mL浓度接种HCMV AD169病毒株于70%～80%融合的VSMC，37?℃吸附1?h后，弃病毒液，用含2%血清的培养基培养8?h后更换含10%血清的培养液。72?h后，收集细胞进行RNA和蛋白的提取。

　　1.3 RTPCR检测 LOX1mRNA和HCMV IE72mRNA的表达 用Trizol试剂提取细胞总RNA,RTPCR操作按试剂盒说明书进行。LOX1上游引物： TTGACCTACCTACATCTGTCACC，下游引物：CAAAGACCAACGAGCAATGA，PCR产物386?bp;IE72上游引物:CCAAGGCCACGACGTTCCTGCAGACTA，下游引物: TGCTCCTTGATTCTATGCCGCACCA，PCR产物390?bp;GAPDH上游引物：GAGCTGAACGGGAAACTCAC，下游引物：GGTCTGGGATGGA AACTGTG，PCR产物476?bp。扩增条件：94?℃变性1?min、58?℃退火1?min、72?℃延伸1?min，共35个循环，最后72?℃延长7?min。取10?μL PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，利用凝胶成像系统扫描图像，并比较目的片断和内对照灰度比值。

　　1.4 Western blotting测LOX1蛋白表达 提取细胞总蛋白分析。做SDSPAGE电泳, 然后电转移至NC膜上。羊抗兔单克隆一抗按1∶200稀释，室温孵育1?h;兔抗羊二抗(1∶1?000)室温下孵育1?h后。用化学发光检测试剂盒显影。

　　1.5 统计学处理 实验数据以±s表示。应用SPSS软件进行分析，多组间的均数比较用方差分析;两组间的均数比较用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 兔VSMC的培养与鉴定以及HCMV AD169感染VSMC的形态改变 VSMC在倒置显微镜下外观呈长梭形，细胞生长致密时排列成束，相互平行，并且重叠生长，表现为典型的“波峰”与“浪谷”状(图1)，免疫组化法进行VSMC肌动蛋白染色，显微镜下可见细胞浆内棕黑色颗粒(图2)。只有HCMV感染VSMC早期，细胞增殖明显，无明显形态变化，而在感染晚期，细胞的形态发生明显变化(图3)。

　　2.2 HCMV增殖的检测结果 见图4。HCMV感染VSMC 3?d后，HCMV组中病毒复制关键基因——IE72的表达明显高于对照组。HCMV侵入VSMC内并且在细胞内进行增殖。

　　2.3 HCMV作用VSMC后LOX1mRNA的表达 HCMV感染VSMC后，细胞LOX1 mRNA表达明显升高，与正常对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。见图5。

　　2.4 HCMV作用VSMC后LOX1蛋白的表达 见图6。HCMV感染后LOX1表达明显高于正常细胞对照组(P<0.01)，提示HCMV感染可以有效地上调平滑肌细胞LOX1蛋白的表达

　　3 讨 论

　　有关AS的发生机制至今尚不十分清楚，目前比较公认的损伤反应假说认为，病毒作为损伤因子在AS发生发展过程中发挥重要作用，病毒可诱导血管壁细胞发生转化或畸变，引起动脉内皮细胞和SMC损伤而导致脂质在内皮下的浸润和SMC的增殖。本研究结果显示，HCMV感染的兔SMC在初期就可观察到细胞增殖，而在晚期则细胞形态发生明显的变化,这与Kloppenburg[6]等的实验结果相一致。另外，虽然HCMV具有宿主特异性,不能感染人以外的动物。但近年资料[7]表明，多种途径接种HCMV AD169可以感染小鼠、大鼠和兔,体外可感染小鼠神经细胞、兔成纤维细胞。本实验首先进行了原代兔主动脉平滑肌细胞培养，经免疫组化实验鉴定平滑肌细胞后，使用第3～8代细胞用于实验。因为这个时期细胞各方面的性状比较稳定。

　　LOX1是C型植物凝集素家庭中的新成员，可在内皮细胞、巨噬细胞和血管平滑肌细胞上表达，许多因素可对它进行调节。该受体可以特异性地结合OXLDL,并诱导单核巨噬细胞转运到SMC, 刺激SMC增生并释放多种炎性细胞因子，同时被SMC内吞并使细胞泡沫化。通过免疫染色的方法，OXLDL已被发现存在于动脉粥样硬化斑块，尤其是不稳定斑块内[8]。体外研究发现，CMV感染可以增加SMC中脂化胆固醇成分,并且CMV感染鼠后血清LDL胆固醇升高。这表明SMC感染HCMV后发生了脂质代谢功能改变[9]。

　　本实验通过检测HCMV ADl69株感染的SMC中LOX1的表达，探讨HCMV，LOX1，AS三者之间的关系。实验结果表明，病毒感染SMC后LOX1的表达明显增加，加剧了SMC泡沫化，降低了动脉粥样斑块的稳定性。在检测LOX1表达的同时，又通过RTPCR来确定受感染的SMC中病毒IE72的表达量，结果病毒复制关键基因即IE72的表达明显高于对照组，这说明在LOX1高表达的同时，HCMV正处于一个增殖阶段。而有研究[1]表明，巨细胞病毒侵入人体后，潜伏于血管平滑肌细胞中，病毒的DNA片段组合到人体血管细胞的DNA中，改变其基因功能和脂质代谢，并激活凝血系统以及相关细胞因子，最终损伤细胞。本实验结果显示，HCMV感染后能引起LOX1的表达上调，提示HCMV感染可以改变与脂质代谢有关的受体活性，进而促使泡沫细胞形成。但其诱导LOX1的表达上调的具体机制尚需进一步探讨。

　　【参考文献】

　　[1] Reinhardt B, Mertens T, MayrBeyrle U, et al. HCMV infection of human vascular smooth muscle cells leads to enhanced expression of functionally intact PDGF betareceptor[J]. Cardiovasc Res, 2005, 67(1):151.

　　[2] Honjo M, Nakamura K, Yamashiro K, et al. Lectinlike oxidized LDL receptor1 is a celladhesion molecule involved in endotoxininduced inflammation[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(3):12741279.

　　[3] Hinagata J， Kakutani M， Fujii T， et al. Oxidized LDL receptor LOX1 is involved in neointimal hyperplasia after balloon arterial injury in a rat model[J]. Cardiovasc Res， 2006， 69(1)：263271.

　　[4] 赵日光.凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体1与动脉粥样硬化的研究进展[J].微循环学杂志, 2008,18(1):5763.

　　[5] Chen R. The relationship between human cytomegalovirus infection and atherosclerosis development[J]. Mol Cell Biochem, 2003, 249(12):9196.

　　[6] Kloppenburg G, de Graaf R, Herngreen S, et al. Cytomegalovirus aggravates intimal hyperplasia in rats by stimulating smooth muscle cell pro1iferation[J]. Microbes Infect, 2005, 7(2):164.

　　[7] 孟红,孙德刚,王健,等.HCMV AD169株大鼠慢性感染模型的初步探讨[J].中华实验和临床病毒学杂志,2000,14(7):271273.

　　[8] Ishino S， Mukai T， Kume N， et al. Lectinlike oxidized LDI receptor1 expression is associated with atheroscIerotic plaque instability analysis in hypercholesterolemic rabbits[J]. Atherosclerosis， 2007， 195(1)：4856.

　　[9] Westphal M, Lautenschlager I, Backhaus C, et al. Cyto2megalovirus and proliferative signals in the vascular wall of CABG patients[J]. Thorac Cardiovasc Surg, 2006, 54(4):219.