趋化因子CXCL10与肿瘤细胞RNA修饰树突状细胞抗前列腺癌研究

　　作者：李博,赵庆利　伦晓勤,魏学斌,李顺,李青 作者单位：1. 山东大学附属千佛山医院泌尿外科， 济南 ; 2. 济南医院职业病科， 济南

 

　　【摘要】 目的 探讨肿瘤细胞RNA和趋化因子CXCL10基因共同修饰的树突状细胞(DC)瘤苗对小鼠抗肿瘤免疫反应的诱导作用。方法 将小鼠RM1前列腺癌细胞RNA加载小鼠骨髓来源的DC后,通过脂质体转染法将CXCL10基因导入DC,制备前列腺癌瘤苗;体内外实验检测该瘤苗诱导的抗前列腺癌免疫治疗作用。结果 转染CXCL10基因的DC上清对淋巴细胞有较强的趋化作用;DC瘤苗所诱导的特异性效应细胞(CTL)对RM1细胞具有特异性杀伤作用;经DC瘤苗治疗的荷瘤小鼠模型瘤体生长减慢,存活期延长;该瘤苗还具有明显的免疫保护作用。结论 构建的前列腺癌DC瘤苗能够有效诱导抗肿瘤免疫反应和免疫保护功能。

　　【关键词】 树突细胞; RNA，肿瘤; CXCL10基因; 前列腺肿瘤; 小鼠

　　gene and tumor cell RNA on mice with prostate cancer

　　LI Bo1, ZHAO Qingli1, LUN Xiaoqin2, WEI Xuebin1, LI Shun1, LI Qing1

　　(1. Department of Urology, Qianfoshan Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250014, China;

　　2. Department of Occupational Diseases, Jinan Hospital, Jinan 250014, China)

　　To evaluate the effect of therapeutic vaccine against prostate cancer based on dendritic cell (DC) vaccine modified with tumor cell RNA and the CXCL10 gene both in vitro and in vivo. Methods Mouse bone marrow DC was pulsed with cell RNA from the RM1 prostate cancer cell line and then transfected with the recombinant plasmid CXCL10/pcDNA3.1 by DOTAP liposome. The immunotherapeutic effects of DC vaccine on mice with prostate cancer were assessed. Results The DC vaccine increased the preferential chemotaxis to T cells, and the mice immunized with DC vaccine exhibited a specific CTL response compared with other groups. In the C57BL/6 mice model with preestablished subcutaneous RM1 prostate cancer, immunization of DC vaccine inhibited tumor growth more significantly when compared with other counterparts and the survival time of micetreated with the DC vaccine was greatly extended. The DC vaccine immunized mice also exhibited an effective resistance to tumor challenge. Conclusion DC vaccine modified with CXCL10 gene and tumor cell RNA might elicit significant antitumor effects through efficient induction of antitumor immunity and might be of therapeutic potentials for prostate cancer.

　　Key words: Dendritic cells; RNA, neoplasm; CXCL10 Genes; Prostatic neoplasms; Mice 树突状细胞(DC)是体内功能最强的专职抗原提呈细胞(APC),也是唯一能诱导初次免疫应答的APC,在机体抗肿瘤免疫反应中起关键作用。研究表明,将肿瘤细胞的RNA加载DC,可诱导强烈的抗肿瘤免疫应答[12]。趋化因子CXCL10(interferon γ

　　inducible protein10,IP10)属于CXC趋化因子超家族的非ELR(glutamic acidleucinearginine)趋化因子,其受体为CXCR3,属于具有7个跨膜区的G蛋白偶联受体,由活化的T细胞表达,CXCL10与之结合后能够对T细胞发挥趋化作用[34]。由于DC的免疫刺激作用有赖于其体内与T细胞的相互作用,增强DC对T细胞的趋化可能更有利于其诱导抗肿瘤免疫反应。本研究将趋化因子CXCL10与小鼠前列腺癌细胞RNA共同修饰DC,构建新的DC瘤苗,观察其诱导抗肿瘤免疫反应作用,以期进一步明确其作用机制,为临床开展抗肿瘤免疫治疗提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂、动物及细胞 C57BL/6(H2Kb,IAb)纯系雄性小鼠,8～10周,体质量18～20?g,购自中国科学院上海实验动物中心。RM1细胞为C57BL/6小鼠来源的前列腺癌细胞株(H2Kb),购自中国科学院上海细胞生物所。OptiMEM无血清培养液,鼠重组白细胞介素4(IL4)和粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)均购自Gibco公司。DOTAP脂质体转染试剂盒购自Roche公司。CXCL10的 ELISA试剂盒为R&D公司产品。分离T细胞用尼龙毛为日本和光纯药工业株式会社产品。小鼠CXCL10真核表达质粒(CXCL10/pcDNA3.1)由复旦大学遗传研究所吴超群教授惠赠。

　　1.2 方法

　　1.2.1 DC的培养扩增及肿瘤细胞RNA加载DC 取C57BL/6小鼠后肢骨,分离骨髓单个核细胞,加入细胞因子GMSCF(10?ng/mL)和IL4(5?ng/mL)培养,扩增DC。收集常规培养5?d的DC,调整细胞浓度为2×106/mL,将RM1细胞的RNA直接加入(25?μg/mL),混匀后在37?℃、5% CO2孵育4?h,收集DC后继续培养24?h,重悬备基因转染。

　　1.2.2 CXCL10/pcDNA3.1转染DC 将CXCL10/pcDNA3.1(2?μg)和DOTAP脂质体(8?μL)加入100?μL OptiMEM无血清培养液中混匀,室温放置45?min,加入重悬的DC,终体积1?mL。37?℃、5% CO2培养4?h后弃混合液,加入完全培液和细胞因子继续培养24?h(CXCL10/RNADC)[5]。

　　1.2.3 转染DC表达CXCL10的趋化活性检测 细胞上清参考Tominaga等[6]的方法测定趋化指数。收集转染24?h的CXCL10/RNADC,设以下4组:单纯转染CXCL10/pcDNA3.1的DC(CXCL10DC组)、负载肿瘤细胞RNA的DC(RNADC组)、转染空载体的DC(pcDNA3.1DC组)和正常对照DC(DC组)。分离C57BL/6小鼠脾细胞,尼龙毛柱分离T细胞,调整细胞浓度为2×106/mL,趋化池下层的复孔加入各组DC上清或鼠重组CXCL10细胞因子,上层加入40?μL的淋巴细胞悬液,37?℃、5% CO2培养3?h,每孔显微镜下计数5个高倍视野,趋化指数=实验孔中迁移的细胞数/对照孔中迁移的细胞数,趋化指数大于2认为对淋巴细胞有趋化作用。

　　1.2.4 CXCL10/RNADC瘤苗诱导效应细胞(CTL)能力及其杀伤活性检测 调整DC细胞浓度为5×106/mL,于C57BL/6小鼠右肩背部分别皮下注射各组DC 1×106/0.2?mL或PBS 0.2?mL,7?d后处死小鼠,采用尼龙毛柱法分离脾脏T细胞。取RM1作为刺激细胞,加入50?μg/mL的丝裂霉素C,37?℃灭活30?min。将T细胞和刺激细胞以10∶1混合,加入细胞因子IL2(100?U/mL)后继续培养,收集共培养5?d?的T细胞作为CTL。将RM1细胞作为靶细胞,调整浓度为1×105/mL,在96孔圆底培养板中每孔加入1×104/100?μL靶细胞,以40∶1和20∶1的效靶比加入效应T细胞100?μL,同时设单一靶细胞、单一CTL及1640空白对照,每组设3复孔。培养板经500?r/min离心30?s,孵育4?h。采用四氮唑蓝(MTT)还原法检测CTL能力及其杀伤活性。特异性细胞杀伤率(%)=[1-(效靶吸光度-效应细胞吸光度)/靶细胞吸光度]×100%。

　　1.2.5 CXCL10/RNADC瘤苗抗肿瘤免疫治疗作用 C57BL/6小鼠随机分为PBS组、DC组、pcDNA3.1DC组、RNADC组、CXCL10DC组和CXCL10/RNADC 6组,每组6只。于右肩背部皮下接种RM1细胞(2×106/只),种瘤后第7天和14天,每只小鼠分别皮下注射各组DC 106个或PBS,种瘤后每3?d用卡尺测量瘤体直径,以1/2(长+宽)表示,并记录小鼠生存时间。当瘤体直径达3?cm或出现严重溃疡时,处死小鼠。

　　1.2.6 CXCL10/RNADC瘤苗诱导抗肿瘤免疫保护作用 C57BL/6小鼠随机分为6组，每组6只,各组皮下注射DC同1.2.5,7?d后皮下接种RM1细胞(2×106/只),记录小鼠瘤体直径和生存时间。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS10.0统计软件,结果以

　　2 结 果

　　2.1 CXCL10趋化功能检测结果 CXCL10/RNADC和CXCL10DC上清的趋化指数分别为2.84±0.38和3.01±0.49,对淋巴细胞有明显趋化作用;而其余各组DC上清的趋化指数均小于2,对淋巴细胞无趋化作用。

　　2.2 CXCL10/RNADC瘤苗诱导CTL能力及其杀伤活性检测结果 见表1。MTT还原法检测显示,用CXCL10/RNADC免疫的小鼠,其脾脏T细胞经RM1诱导后,对RM1肿瘤细胞的特异性细胞杀伤率高于CXCL10DC、RNADC、pcDNADC、DC和PBS免疫的小鼠,差异有统计学意义(P<0.01)。表1 各组DC诱导的CTL对RM1的特异性细胞杀伤率

　　2.3 CXCL10/RNADC瘤苗诱导机体产生的免疫保护作用 经CXCL10/RNADC免疫的小鼠可以抵抗RM1细胞的攻击。RM1细胞接种24 d后,PBS、DC、pcDNA3.1DC、RNADC、CXCL10DC和CXCL10/RNADC?免疫小鼠的瘤体平均直径分别为(17.67±2.15)、(16.33±1.97)、(15.52±1.69)、(7.83±0.92)、(12.17±1.48)和(1.22±0.25)mm,CXCL10/RNADC免疫小鼠接种RM1后与其他各组相比,肿瘤生长明显缓慢(P<0.05)。在RM1细胞接种后65 d,CXCL10/RNADC免疫组小鼠仍有50%(4/8)无肿瘤生长,RNADC免疫组小鼠仅有12.5%(1/8)无肿瘤生长,而其余各组小鼠均见肿瘤生长。CXCL10/RNADC免疫的小鼠与PBS、DC、pcDNADC、RNADC和CXCL10DC相比,在RM1细胞攻击后存活期延长,差异有统计学意义(P<0.05),见图2。

　　3 讨 论

　　T细胞介导的免疫应答在机体抗肿瘤过程中起着主导作用,T细胞的致敏、激活和扩增依赖于APC 提呈相应的抗原多肽并提供共刺激信号。通过调节肿瘤抗原的提呈以增强抗肿瘤免疫应答是当前肿瘤免疫治疗的一个重要策略。DC作为人体内抗原提呈能力最强的APC,在机体免疫应答中具有独特地位,是肿瘤免疫治疗研究的热点之一[79]。

　　CXCL10主要由活化的单核细胞、成纤维细胞、内皮细胞和角化细胞产生,能够诱导活化的T细胞趋化和抑制血管生成。将CXCL10基因转染的肿瘤细胞或表达CXCL10的病毒载体直接瘤体内注射,均能明显抑制肿瘤生长,使肿瘤出现局部坏死,T细胞浸润增加,微血管密度下降[1011]。

　　目前,以DC为基础的前列腺癌免疫治疗研究主要是将肿瘤相关抗原(如PSA、PSMA和PAP等)致敏DC,但是这些治疗方法的疗效尚不稳定。单一抗原肽免疫有其局限性,不一定能在体内诱导出最佳的抗肿瘤免疫反应[12]。

　　本实验采用肿瘤细胞的RNA作为肿瘤抗原加载DC,这种全部肿瘤细胞抗原与单一肿瘤抗原相比,其优势在于无需鉴定肿瘤抗原表位,而且多效价的肿瘤疫苗能够有效的防止由于抗原变异而引起的免疫逃避,从而进一步扩大所诱导的T细胞反应。另外与其他全肿瘤疫苗需要大量肿瘤组织来制备的方法相比,RNA可从少量肿瘤细胞中分离并通过体外扩增而充足的获得,解决了制备抗原时所用肿瘤细胞来源有限的问题,使该疫苗可用于术后或肿瘤负荷较小的患者[13]。

　　为了能够更有效的诱导体内抗肿瘤免疫反应,鉴于趋化因子CXCL10对活化T细胞的趋化作用,本研究着眼于DC和T细胞体内作用的微环境,将肿瘤细胞RNA加载DC后,再将CXCL10基因导入DC,构建了CXCL10/RNADC新型瘤苗,通过CXCL10基因的表达,使DC瘤苗能够选择性的趋化T细胞,增加了其与T细胞接触的机率和相互作用,促进了抗原的有效提呈。本实验结果显示,与单纯加载肿瘤细胞RNA的RNADC相比,CXCL10/RNADC瘤苗对淋巴细胞具有明显趋化作用,其诱导的CTL对RM1肿瘤细胞具有较强的特异性杀伤作用;经该瘤苗治疗的荷瘤小鼠瘤体生长减慢,生存期延长;且经CXCL10/RNADC瘤苗免疫的小鼠,能有效抵抗RM1肿瘤细胞的攻击。证明所构建的DC瘤苗具有明显的抗肿瘤治疗作用和免疫保护作用,为以DC为基础的前列腺癌免疫治疗与基因治疗提供了一条新的治疗策略。

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