肺腺癌中DNA甲基转移酶1的表达

　　【摘要】 目的 检测肺腺癌中DNA甲基转移酶1(DNMT1)蛋白水平的表达，探讨其在肺腺癌发生中的作用及其预后价值。方法 采用免疫组织化学法检测95例肺腺癌和癌旁正常组织中DNMT1的蛋白表达状况，随访患者并采用SPSS13.0软件进行统计学分析。结果 95例肺腺癌中有48例患者呈癌组织DNMT1阳性表达(50.5%)，癌旁正常肺组织中DNMT1阴性表达;DNMT1蛋白表达与性别显著相关(P=0.018)，女性肺腺癌患者中表达明显增高，与年龄、吸烟、肿瘤大小、淋巴结转移、组织学分级、临床分期之间的相关性差异无统计学意义(P>0.05)。肺腺癌患者总生存率、2年生存率和无病生存率在DNMT1的蛋白表达阳性率为31.91%、65.07%、26.85%，阴性率为62.88%、83.01%、48.65%。 Kaplan Meier法和LogRank法分析显示，DNMT1蛋白阳性表达是肺腺癌患者预后差的标志(P<0.05)。结论 肺腺癌早期DNMT1蛋白可能高表达，在其发生发展中起着重要的作用并与患者的预后密切相关，可以作为检测早期肺腺癌的分子标志物及肺腺癌患者预后不良的指标。

　　【关键词】 DNA甲基化;肺肿瘤;预后

　　YANG Xi1, GAO Peng2, XUE Yuwen1, WANG Yan2, LIU Wenjun2, ZHANG Xiaofang2

　　(1. Department of Respiration, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China;

　　2. Department of Pathology, School of Medicine, Shandong University, Jinan 250012, China)

　　To explore the role of protein expression of DNA methyltransferase 1 (DNMT1) in lung adenocarcinoma carcinogenesis and prognosis. Methods DNMT1 protein expression levels in 95 tumor specimens and adjacent normal tissues were determined by immunohistochemistry. Comparisons of the survival rate and recurrence between positive and negative DNMT1 were conducted with SPSS13.0 software. Results None of the 95 noncancerous tissues exhibited DNMT1 immunoreactivity, whereas 48 (50.5%) of the 95 lung adenocarcinoma cancerous tissues were DNMT1positive. There was a significant correlation between DNMT1 overexpression and gender (P=0.018), which was much more obvious in females. No correlation was found between DNMT1 expression and patient age, smoking, lymph node metastasis, tumor types and clinical stages (P>0.05). In addition, general survival rate， 2year survival rate and diseasefree rate in patients with DNMT1positive were 31.91%, 65.07% and 48.65% respectively, while in patients with DNMT1negative they were 62.88%，　83.01% and 26.85%. DNMT1 protein overexpression served as a marker of poor prognosis by KaplanMeier and LogRank analysis(P<0.05). Conclusion DNMT1 overexpression is an early event of lung adenocarcinoma carcinogenesis and plays a significant role in the development of lung adenocarcinoma. It may serve as a molecule marker to detect lung adenocacinoma in an early stage and an indicator of unfavourable prognosis.

　　Key words： DNA methylation; Lung neoplasms; Prognosis

　　抑癌基因由于启动子区域高甲基化而失活是恶性肿瘤发生的一个重要因素，其中DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMTs)在抑癌基因甲基化过程中起关键作用。国内外已有研究表明，DNMTs的mRNA在乳腺癌、肝癌、前列腺癌、结直肠癌等多种癌组织中表达增高。目前， 国外关于肺癌中的DNMTs表达的研究尚处于起步阶段，国内未见相关报道。近几年，据WHO最新肿瘤病理学分类，肺腺癌已经超过鳞癌成为肺癌最主要的组织类型[1]。本研究检测DNMT1在肺腺癌中蛋白水平的表达状况，探讨其在肺腺癌发生中的作用及其预后价值。

　　1 资料与方法

　　1.1 资料

　　1.1.1 标本收集 收集2004年至2006年山东大学齐鲁医院病理科存档标本95例。HE染色后确诊为肺腺癌，根据美国联合癌症分类委员会(AJCC)和国际抗癌联盟(UICC)2002年制定的TNM分期标准、WHO组织学分级进行临床分期和病理分级。

　　1.1.2 药品 山羊抗人DNMT1一抗购自Santa cruze公司;多聚赖氨酸、苏木素由山东大学病理实验室提供;即用型SP试剂盒(3%双氧水、封闭血清、兔抗山羊二抗、辣根酶标记链霉卵白素)、DAB染色试剂盒均系北京中杉金桥有限公司生产。

　　1.2 方法

　　1.2.1 免疫组织化学染色 所有肺癌组织均为10%的福尔马林固定、石蜡包埋的标本，组织切片厚度为4?μm(所有病例均取癌旁正常组织做对照),载玻片均用多聚赖氨酸进行防脱片处理，脱蜡水化后微波修复抗原15?min，加入3%双氧水、封闭血清，山羊抗人DNMT1一抗(1∶200稀释)4?℃孵育过夜，加入兔抗山羊二抗，辣根酶标记链霉卵白素，DAB显色，苏木素复染。加入PBS代替一抗作为阴性对照，预实验阳性切片作为阳性对照。

　　1.2.2 结果分析 DNMT1免疫组化染色定位于细胞核，细胞核染成棕黄色为阳性细胞，每例标本选取10个DNMT1高倍视野观察，阳性细胞占所有观察细胞总量30%以上的为免疫组织化学染色结果阳性[2]。

　　1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件分析结果。χ2检验分析DNMT1表达与肺腺癌患者的性别、年龄、吸烟、肿瘤大小、淋巴结转移、组织学分级、临床分期的关系，KaplanMeier法和LogRank法分析DNMT1表达与总生存率、两年生存率、无病生存率(复发、转移和肺腺癌相关死亡作为一个终点事件)的关系。

　　2 结 果

　　2.1 肺腺癌中DNMT1表达及其与临床病理参数的相关性 分析48例(50.5%)肺腺癌呈癌组织DNMT1阳性表达，见图1。癌旁正常肺组织中均未见DNMT1表达，见图2。 肺腺癌DNMT1蛋白表达与患者性别显著相关(P=0.018)，女性肺腺癌患者中DNMT1表达率明显增高，而DNMT1蛋白表达与年龄、吸烟、肿瘤大小、淋巴结转移、组织学分级、临床分期之间的相关性无统计学意义，见表1。

　　2.2 肺腺癌DNMT1蛋白表达与患者总生存率、2年生存率、无病生存率的关系 随访率75%(71/95)，随访时间1～45个月(平均随访时间22个月)，DNMT1阴性表达患者的无病生存率(48.65%)显著高于DNMT1阳性表达患者(26.85%，P<0.05)。DNMT1阳性表达患者的总生存率和2年生存率(31.91%、65.07%)显著低于DNMT1阴性表达患者(62.88%、83.01%，P<0.05)。KaplanMeier法和LogRank法进行生存分析，显示肺腺癌患者中DNMT1的蛋白表达阳性比阴性表达者预后差，见图3～5。

　　肺腺癌中DNMT1阳性表达，阳性细胞呈细胞核棕黄色染色，阳性细胞比例超过30%(SP法，×400) 癌旁正常肺组织DNMT1呈阴性表达(SP法，×400)

　　3 讨 论

　　许多研究证明，DNMT1在实体瘤和造血系统肿瘤中表达明显增高[3]。用RTPCR法研究DNMTs在正常血细胞和急慢性髓性白血病中的mRNA表达时发现：DNMT1在急性髓性细胞白血病和慢性髓性细胞白血病急性期的mRNA表达比正常骨髓细胞对照分别增高5.3和3.2倍。Park HJ[4]用RTPCR法测得DNMT1mRNA在肝癌和正常肝组织的表达分别为33.3%和40.7%，免疫组织化学法测得其蛋白表达分别为100%和52%，但在肝癌组织中抑癌基因却存在高甲基化状态，DNMTs mRNA和蛋白表达、DNA甲基化之间没有统计学意义，推论出DNA甲基化是一个十分复杂的过程，可能存在别的机制引起DNA的高甲基化。

　　本研究选取了95例肺腺癌手术标本，用免疫组织化学法测定DNMT1在癌组织和癌旁正常组织中的表达情况。结果显示，在癌组织中有48例(50.5%)出现DNMT1阳性表达，而在癌旁正常组织中均为阴性表达，癌组织中DNMT1的蛋白表达明显高于癌旁正常组织。并且DNMT1在肿瘤直径小、临床分期低、没有淋巴结转移的早期肺腺癌中表达率，与肿瘤直径大、临床分期高、有淋巴结转移的中晚期肺腺癌的表达率没有显著差异，这说明DNMT1只在肺腺癌中阳性表达，而在正常肺组织中不表达，而且其表达在早期肺癌中就已出现。提示DNMT1阳性表达是肺腺癌发生中的早期分子事件，DNMT1的蛋白检测将可能成为早期发现肺腺癌的分子标志。同时表明，DNMT1在早期肺腺癌出现高表达后，在癌症的发展中仍处于高水平状态，可能与DNMT1在维持DNA甲基化方面的作用密切相关。

　　本研究结果还显示， DNMT1在肺腺癌中的表达存在性别差异，女性肺腺癌中表达增高(P=0.018)， Lin TS[5]也曾发现女性肺腺癌患者的DNMT3b蛋白表达明显高于男性鳞癌患者(P=0.015)，提示DNMT1的表达增高与雌激素等可能有关系，有待进一步研究。本研究结果表明，DNMT1的表达与吸烟无关，这与Kwon YM[6]研究显示吸烟>65包/年的肺癌患者DNMT1的mRNA表达是吸烟<45包/年肺癌患者的4.17倍(P=0.007)的结果不同，我们推断导致DNMT1蛋白在肺腺癌中表达增高的机制比较复杂，吸烟可能并不是导致肺腺癌中DNMT1增高的独立危险因素。同时根据年龄平均值分成两组，也没有观察到显著差异，说明年龄并非是DNMT1蛋白表达增高的敏感因素。

　　随访结果显示，DNMT1阳性表达的患者总生存期、2年生存期、无病生存期短,与Lin RK[7]的结果相同。

　　综上所述，本研究结果显示DNMT1蛋白高表达是肺腺癌发生中的早期事件，在发生发展中起着重要的作用并与患者的预后密切相关，可以作为检测早期肺腺癌的分子标志物及肺腺癌患者预后不良的指标。

　　【参考文献】

　　[1] Travis W D, Brambilla E, Harris C C， et al. World Health Organization Classification of Tumors, Pathology and Genetics of Tumors of the lung, pleura, Thymus and Heart[M]. Lyon: IARC Press, 2004: 3540.

　　[2] Etoh T, Kanai Y, Ushijima S, et al. Increased DNA methyltransferase 1 (DNMT1) protein expression correlates significantly with poorer tumor differentiation and frequent DNA hypermethylation of multiple CpG islands in gastric cancers[J]. Am J Pathol, 2004, 164(2):689699.

　　[3] Mizuno S, Chijiwa T, Okamura T, et al. Expression of DNA methyltransferases DNMT1, 3A, and 3B in normal hematopoiesis and in acute and chronic myelogenous leukemia[J]. Blood, 2001, 97(5):11721179.

　　[4] Park H J, Yu E, Shim Y H. DNA methyltransferase expression and DNA hypermethylation in human hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Lett, 2006(233):271278.

　　[5] Kwon Y M, Park J H, Kim H, et al. Different susceptibility of increased DNMT1 expression by exposure to tobacco smoke according to histology in primary nonsmall cell lung cancer[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2007, 133(4):219226.

　　[6] Lin T S, Lee H, Chen R A, et al. An association of DNMT3b protein expression with P16INK4a promoter hypermethylation in nonsmoking female lung cancer with human papillomavirus infection[J]. Cancer Lett, 2005, 226(1):7784.

　　[7] Lin R K, Hsu H S, Chang J W, et al. Alteration of DNA methyltransferases contributes to 5′CpG methylation and poor prognosis in lung cancer[J]. Lung Cancer, 2007, 55(2):205213.