骨桥蛋白促进卵巢癌细胞SKOV3侵袭潜能的实验研究

　　【摘要】 目的 检测卵巢癌细胞株SKOV3中骨桥蛋白(OPN)的表达，探讨OPN对卵巢癌细胞侵袭潜能的影响。 方法 pcDNA3.1(-)/OPN重组质粒转染SKOV3细胞，以空质粒转染作对照。采用RTPCR及Western blot法检测OPN mRNA和蛋白表达水平，并用基质凝胶侵袭实验检测两组细胞侵袭力。 结果 重组质粒转染SKOV3细胞后OPN mRNA和蛋白表达明显升高。侵袭实验证实重组质粒转染组细胞侵袭力明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 OPN对卵巢癌细胞的侵袭潜能有促进作用。

　　【关键词】 卵巢肿瘤;骨桥蛋白;侵袭

　　carcinoma cell line SKOV3: an experimental study

　　LI Huihui1, ZHANG Linfan2, GU Shuang3, ZHANG Xiangning1

　　(1. Department of Obstetrics and Gynecology, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China;

　　2. Department of Obstetrics and Gynecology, Mengyin People′s Hospital, Mengyin 276200, Shandong, China;

　　3. Department of Obstetrics and Gynecology, Shenyang Fourth People′s Hospital, Shenyang 110000, China)

　　To investigate the expression of Osteopontin (OPN) and explore its effect on the invasiveness of human ovarian carcinoma cell line SKOV3. Methods Human ovarian carcinoma SKOV3 cells were transfected with plasmid pcDNA 3.1(-)/OPN and cells transfected with a mock plasmid served as controls. RTPCR and Westernblot were used to determine the expressions of OPN mRNA and proteins. Cell invasiveness was measured by the matrigel invasion assay. Results Expressions of OPN mRNA and protein were significantly increased (P<0.01) after transfection. Migrating numbers of SKOV3 cells transfected with pcDNA 3.1(-)/OPN were also significantly increased (P<0.05) as compared with the control group. Conclusion OPN play an important role in the metabasis of ovarian cancer.

　　Key words: Ovarian neoplasms; Osteopontin; Invasiveness 卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，其浸润、转移给治疗带来极大困难，因而从分子水平探讨卵巢癌的转移机制将为临床治疗提供依据。骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是细胞外基质中具有多种生物学活性的分泌型磷酸化糖蛋白，能作用于肿瘤发生发展转移的多个环节，参与细胞信号转导，促进细胞粘附和迁移，并与肿瘤细胞的生长、侵袭、转移密切相关，被称为肿瘤转移相关基因[1]，但其在卵巢癌转移过程中的确切机制尚未阐明。因此本研究将OPN重组质粒转染人卵巢癌细胞株SKOV3，并转染空白质粒作对照，采用RTPCR和Western blot法检测转染后OPN的表达，再对侵袭力进行检测，以观察OPN对卵巢癌细胞侵袭潜能的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞和试剂 卵巢癌细胞株SKOV3由山东大学齐鲁医院中心实验室冻存。pcDNA3.1(-)质粒、pcDNA3.1(-)/OPN重组质粒由Yeatman TJ教授惠赠，Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。Trizol、DNAmarker购自TaKaRa公司，逆转录及PCR所用试剂为Promega公司生产。OPN鼠抗人单克隆抗体、βactin抗体系美国SantCruz公司产品，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体购自北京中山生物技术有限公司。RIPA裂解液购自Sigma公司，丙烯酰胺、TMEMD、SDS、NC膜等试剂购自Ameresco公司，DAB试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。侵袭小室购自BD公司,人工基质凝胶购自Merk公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 细胞复苏后培养于含有10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，常规培养于5%CO2+95%空气，37?℃孵箱中，待其2～3?d贴壁生长至70%～80%融合时，用0.25%的胰酶消化传代。

　　1.2.2 细胞稳定转染和稳定细胞株的筛选 转染前1?d按5×105/孔在6孔细胞培养板接种指数期生长的细胞，直至细胞90%～95%融合。用脂质体Lipofectamine 2000介导转染重组质粒pcDNA3.1(-)/OPN，同时转染空载体pcDNA3.1(-)作为对照(质粒与脂质体混合，按试剂操作说明进行)。并利用G418(250mg/L维持浓度)筛选，2周后获稳定转染细胞株。

　　1.2.3 逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测OPN mRNA表达 按照Trizol说明书抽提细胞总RNA，紫外分光光度仪定量。取2μg总RNA按MMLV逆转录酶步骤逆转录为cDNA。PCR经优化反应条件，总体系为20?μL。参照文献[2]设计相应引物,由上海生工技术公司合成，碱基序列如下。OPN引物序列为上游：5′TGGCCGAGGTGATAGTGTGGTTTA3′，下游：5′TTCTTCCTTACTTTTGGGGTCTA C3′扩增产物411?bp。内参βactin引物序列为上游：5′TGGGCATGGG TCAG AAG GAT3′，下游：5′AAGCATTTGCGGTGGACGAT3′，扩增产物110?bp。PCR反应条件：95?℃?预变性5?min,94?℃ 30?s,56?℃ 30?s,72?℃延伸1?min,?循环30次,终末72?℃延伸10?min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察并拍照。Touching凝胶成像系统分析条带灰度值，并与βactin相比较计算结果。

　　1.2.4 Western blot检测OPN蛋白表达 细胞在6孔板中培养至80%左右融合时，用 RIPA裂解液裂解细胞，冰浴30?min后12?000?r/min离心30?min收集上清液，考马斯亮蓝法检测蛋白浓度。分取各组蛋白于10%聚丙烯酰胺电泳分离，分离后将蛋白转移至NC膜，室温封闭1?h。分别加鼠抗人OPN单克隆抗体、βactin抗体(1∶500稀释)，4?℃孵育过夜。漂洗，加辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体(1∶2000稀释)，室温孵1?h，漂洗，用DAB显色盒显示蛋白条带。采用Touching凝胶成像系统软件测定Western blot条带净灰度值，并与内参结果比较，计算其比值。

　　1.2.5 基质凝胶侵袭实验检测细胞侵袭力 采用美国BD公司24孔基质凝胶侵袭小室，上下室间滤膜孔径为8?μm，滤膜的上室面覆有浓度为0.5?mg/mL人工基质凝胶。取重组质粒转染组及空白质粒对照组SKOV3细胞以无血清RPMI1640制成1×105/mL单细胞悬液，取100?μL移入上室内，下室内加入600?μL含有20%小牛血清的RPMI1640，置于37?℃，5%CO2孵箱内孵育24?h后取出，以棉签小心刮除滤膜上室面的细胞，侵袭到下室面的细胞以甲醇固定，伊红染色，在×400光镜下随意取9个视野计数细胞数,取其均值,每组设3个复孔,以侵袭细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。

　　1.2.6 统计学处理 所有统计处理均由SPSS13.0分析软件完成。实验结果率的比较采用χ2检验,表达比以

　　2 结 果

　　2.1 RTPCR检测结果 见图1。重组质粒转染组及空白质粒对照组均在411、110?bp出现特异性的OPN基因条带和βactin条带。以OPN和βactin电泳条带扫描值的比值作为OPN表达的相对值，半定量分析OPNmRNA的表达水平。重组质粒转染组OPN的相对表达量(1.268±0.046)明显高于空质粒转染组(0.550±0.027), 差异有统计学意义(P<0.01)。

　　2.2 Western blot检测蛋白结果 见图2。SKOV3细胞稳定表达OPN，重组质粒转染组OPN的蛋白表达(0.642±0.079)较空白质粒转染组高(0.371±0.033)，差异有统计学意义(P<0.01)。

　　2.3 OPN对SKOV3细胞侵袭力的影响 见图3。重组质粒转染组细胞透膜细胞数为(36.459±4.447),空白质粒对照组细胞透膜细胞数为(18.128±6.017)，差异有统计学意义(P<0.05)。

　　SKOV3细胞转染不同质粒后穿透基底膜的数目 (伊红染色 ×400)

　　3 讨 论

　　OPN是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸残基的磷酸化酸性糖蛋白分子，可被凝血酶等多种蛋白酶切割为两个功能区，即包含RGD序列的N端片段(经磷酸化后可与整合素结合)和可结合CD44黏附分子的C端片段。其N端功能区与肿瘤播散有关;C端功能区与免疫逃逸有关;RGD结构对OPN的黏附功能起重要作用。近年来对OPN与肿瘤的发生发展、特别是肿瘤转移的相关性正开始引起研究者的关注[34]。故本实验选择卵巢恶性肿瘤组织中最常见的细胞学类型即上皮性癌细胞SKOV3为代表，对OPN的表达进行检测，以期阐明其在卵巢上皮性癌中的作用。

　　Coppola等[5]采用免疫组化法在胃癌、大肠癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌中均检测到OPN的过度表达，并认为OPN的表达与肿瘤的分期及其特定部位相关。Rosen等[6]报道，在正常的卵巢上皮细胞中无OPN的表达;在卵巢肿瘤细胞质和基质区域发现有OPN表达，而且在卵巢囊腺瘤、交界性卵巢肿瘤和浆液性卵巢恶性肿瘤中OPN的表达水平依次升高。本实验采用RTPCR及Westernblot方法均在卵巢癌细胞中检测到OPN的高表达，这与前述报道结果相一致，并由此推断OPN的表达与卵巢肿瘤的发生有一定相关性。

　　研究表明，转移相关基因启动了肿瘤细胞的迁移[7]。同时恶性肿瘤细胞的局部侵袭和远处转移又是一个多因素、多步骤的复杂过程。肿瘤细胞在侵袭和转移过程中合成及分泌大量基质降解酶降解细胞外基质，从而促进肿瘤细胞侵袭和转移。有学者认为OPN与受体分子结合后激活相关信号通路可促进肿瘤细胞的迁移[8];运用siRNA技术抑制OPN的表达则可以通过下调基质金属蛋白酶等基因的表达抑制肿瘤细胞的转移和侵袭[9]。本实验将OPN重组质粒及空白质粒分别转染入卵巢上皮性癌细胞SKOV3后，RTPCR及Westernblot检测两组细胞OPN表达情况，结果显示重组质粒转染组较空白质粒对照组mRNA及蛋白表达增加，体外观察细胞侵袭力变化，重组质粒转染组细胞透膜细胞数较空白质粒对照组明显增加，差异有统计学意义，证实OPN能显著促进SKOV3细胞的侵袭游走能力。由此推断，OPN的高表达与肿瘤细胞的侵袭转移密切相关。但具体促转移机制尚不清楚，有待于进一步研究。

　　Weber等[10]提出OPN基因C段可与巨噬细胞/肿瘤细胞上的CD44受体结合，引起靶细胞的趋化，使活化的靶细胞到达OPN发生裂解的位置;接着其N段片段和靶细胞上的整合素结合，并激活蛋白磷酸化的反应，靶细胞通过OPN片段结合在基质上，进一步激活靶细胞，通过分泌MMPs等降解细胞外基质并在基质中扩散。Teramoto等[11]提出了OPNCD44Rac(Rac是Rho的变异体，而Rho是Ras基因的超家族成员)旁分泌通路，其实验发现，OPN缺失RGD序列时可与CD44结合，并同时高表达于肿瘤组织中。通过以上观察推测, 作为一个肿瘤转移相关蛋白，OPN能通过多种通路参与恶性肿瘤的进展和转移。已有实验证明[12]，OPN的表达可以在基因水平及mRNA水平进行抑制，OPN蛋白合成可以通过抗体及合成肽予以阻滞。综合本实验研究结果，表明OPN可以通过某种信号通路促进肿瘤的侵袭转移，从而可为寻找卵巢癌的基因诊断和治疗提供实验依据。

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