眼针疗法对肠易激综合征模型大鼠结肠组织5-羟色胺4受体表达的影响

　　【摘要】 　　目的 研究肠易激综合征(IBS)模型大鼠远端结肠组织5-羟色胺4受体(5-HT4R)的表达以及眼针干预的影响。方法 实验动物分成正常对照组、IBS模型组、眼针组,采用束缚刺激与应激刺激相结合的方法建立IBS动物模型并进行眼针干预。采用Western-Blot法、RT-PCR法检测各组大鼠远端结肠组织中5-HT4R的蛋白和mRNA表达。结果 与正常对照组比较,IBS模型组5-HT4R的蛋白和mRNA表达均下调;而与IBS模型组比较,眼针组5-HT4R表达明显上调。结论 IBS模型大鼠结肠组织5-HT4R水平下调,提示5-HT4R可能是IBS分子生物学基础之一,为IBS的治疗提供了分子靶点。眼针干预可有效改善IBS大鼠5-HT4R表达水平。

　　【关键词】 肠易激综合征;5-羟色胺4受体;眼针疗法;大鼠

　　Effects of Ocular Acupuncture Therapy on Colonic 5-HT4 Recepters in Rats with Irritable Bowel Syndrome

　　SONG Shi-yi, WANG De-shan, WANG Yan-jie, et al

　　(College of Basic Medicine, Liaoning University of TCM, Shenyang 110032, China)

　　Abstract：Objective To investigate the expression of 5-HT4 recepters of distal colonic mucosa in the rat with irritable bowel syndrome (IBS) and effects of ocular acupuncture therapy (OAT). Methods Animals were classified into blank control, IBS model and OAT groups. Rat model of IBS was established by method of stress and bound, and OAT was given. The mRNA and protein content of 5-HT4 recepters of distal colonic mucosa of each group was examined by Western-Blot and RT-PCR. Results The mRNA and protein expression of 5-HT4 recepters in IBS model decreased remarkably compared with those in control. The expression of 5-HT4 recepters in OAT increased remarkably compared with those in IBS model. Conclusions The expression of 5-HT4 recepters is significantly decreased in IBS model, suggesting that 5-HT4 receptors are involved in the pathogenesis of IBS, which may offer a molecular target for treatment. OAT can improve 5-HT4 recepters function effectively.

　　Key words：irritable bowel syndrome;5-HT4R;ocular acupuncture therapy;rats

　　目前大多数研究表明,肠易激综合征(Irritable bowel syndrome,IBS)患者血浆及结肠黏膜内5-羟色胺(5-HT)含量升高,可能与IBS患者肠道5-HT受体异常有关。有关5-HT4受体(5-HT4R)的研究表明,5-HT4R在IBS病理生理中起重要介导作用。本研究旨在通过检测IBS模型大鼠远端结肠组织5-HT4R的表达以及眼针干预的影响,来进一步研究眼针治疗IBS的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物

　　选用健康SPF级Wistar雄性大鼠,11周龄,体重(240±20)g,北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证编号：SCXK(京)2007-0001。大鼠饲养适应3 d后进行实验,自由摄食及饮水。饲养期间每日8:00-16:00时给予恒定灯光照明。

　　1.2 试剂与仪器

　　rabbit-anti-rat 5-HT4R抗体(美国Santa Cruz);mouse- anti-rat β-actin抗体(美国Abcam);小鼠及兔的二抗(美国KPL);Trizol试剂(美国Invitrogen);SDS-PAGE仪(美国BIO-RAD);DYCZ-40B型电泳转移槽(北京市六一仪器厂);图像分析系统(美国UVP)。引物由大连宝生物工程合成,引物设计参照文献及核苷酸序列数据库：5-HT4R F1 CCCTGGATAGGTATT ATGCCATC,R1 GTCTTGGCTGCTTTGGTCTC,436 bp;β-actin ACTIN F1 CCTAGGCACCAGGGTGTG,R1 GATGGCATGAGGGAGCG,414 bp。

　　1.3 分组与造模

　　采用随机数字法分成对照组、模型组、眼针组,每组10只。造模方法按文献[1]方法进行改良,模型组、眼针组每日放入自制束缚性鼠笼(直径5 cm,长度20 cm,钢丝网制)1 h进行束缚刺激,并每日依次交替进行一项下列应激刺激：①禁水24 h;②置于温箱40 ℃,5 min;③电击刺激30 V,电击5 s间歇5 s,共120 s;④冷水游泳,14 ℃ 5 min;⑤禁食24 h;⑥夹尾180 s。共循环3次,计18 d造模结束。对照组不做任何处理。

　　1.4 眼针干预

　　眼针组在IBS大鼠造模成功后第2日开始,取下焦区、大肠区、肝区、脾区针刺,定位参照人体取穴方法;用31号13 mm毫针,于大鼠眶周2 mm处平刺,进针3 mm,留针20 min,留针期间捻转行针3次,每次1 min,每12 h针刺1次,针刺7 d。

　　1.5 标本采集

　　标本采集前24 h禁食,各组大鼠水合氯醛麻醉、开腹,在距肛门上10 cm处取远端结肠,肠段长约2 cm,液氮冻存后-80 ℃保存。

　　1.6 RT-PCR法测定5-羟色胺4受体表达

　　参照说明书,用Trizol试剂从大鼠结肠组织抽提总RNA,空气干燥后,溶解于无RNase水中,-80 ℃保存备用。转成cDNA时取上述RNA溶液稀释,测定吸光度,计算RNA 浓度。在25 ?L逆转录体系中,加入总RNA 1 ?g,以反转录反应液1.0 ?L作为模板,加入上下游引物各25 pmol,在Gene Cycler中进行PCR扩增,β-actin为内参照。首先94℃预变性3 min,以后94 ℃变性45 s→58 ℃退火45 s→72 ℃延伸45 s,共35个循环,72 ℃再延伸7 min终止反应,4 ℃保存。取6 ?L PCR产物和标准分子Marker ladder加入20 g/L琼脂糖凝胶内,80 V电泳40 min,凝胶置凝胶成像及分析系统拍照,密度扫描,然后用其表达量与对应的β-actin表达量的比值进行比较分析。

　　1.7 Western-Blot法测定5-羟色胺4受体蛋白表达

　　将标本剪成1 mm3的碎块,PBS充分洗涤后,加入蛋白提取液4 ℃孵育2 h。离心,变性,取上清待用或者-80 ℃保存。在标本中加入等体积的上样10 min,行SDS-PAGE电泳,每道加样10 ?L,Marker 6 ?L。电泳后利用湿转移电泳法将蛋白转移至PVDF膜上。室温下将膜浸入5%脱脂牛奶中封闭2 h,再分别与一抗rabbit-anti-5-HT4R(1∶200)、mouse anti-β-actin (1∶1 000)4 ℃孵育过夜。室温下,将膜分别与小鼠及兔来源的二抗(分别是1∶1 000和1∶500)孵育2 h。ECL显色后照相。图像分析,测5-HT4R和β-actin的灰度比值。

　　1.8 统计学方法

　　实验数据以—(—数)±s表示,采用SPSS12.0软件处理,组间比较采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 一般状态

　　实验过程中动物无死亡。实验动物的一般状态观察结果：与对照组比较,IBS模型大鼠出现易怒好斗、毛色晦黯、食欲下降等表现,稀便状态持续存在,慢性腹泻形成,观察结肠组织病理学、结肠转运功能和肠道敏感性等的变化,对模型进行评价,依据成模标准表明造模成功[1]。经过眼针干预后大鼠一般状态明显改善,便质逐渐恢复正常。

　　2.2 眼针疗法对5-羟色胺4受体mRNA表达水平的影响(见图1)

　　由图1可见,在β-actin扩增效率大致相同的情况下,与对照组比较,模型组5-HT4R mRNA表达减少;而与模型组比较,眼针组5-HT4R mRNA表达上调。

　　2.3 眼针疗法对5-羟色胺4受体蛋白表达水平的影响(见图2)

　　由图2结果可见,与对照组比较,模型组5-HT4R蛋白表达下调;与模型组比较,眼针组5-HT4R蛋白表达明显上调。

　　2.4 眼针疗法对5-羟色胺4受体mRNA、蛋白相对表达量的影响

　　表1 各组大鼠远端结肠粘膜上皮5-HT4R mRNA、蛋白相对表达量的变化(略)

　　3 讨论

　　胃肠道多种细胞都发现有5-HT4R,包括肠嗜铬细胞(EC)、分泌细胞和神经细胞等。5-HT4R位于黏膜下神经丛的IPANs末端、肠肌间神经丛的突触内以及神经肌肉接头处[2]。与5-HT3R和5-HT1R不同,肠壁5-HT4R是唯一突触前性的,并不直接引起突触后反应,所有对5-HT的突触后反应都是由其他类型的5-HT受体介导的[3]。

　　5-HT4R是一种G蛋白偶联受体,激活5-HT4R会增强蛋白激酶途径的神经信号传导。首先通过5-HT4R激活腺苷环化酶,使环磷酸腺苷(cAMP)产生增多,进而激活cAMP依赖性蛋白激酶A,引起钾通道的关闭,膜去极化,开放电压敏感性钙通道,随着Ca2+内流的增加,激发其他神经递质如降钙素基因相关肽、P物质和Ach等的释放,从而影响胃肠道动力及内脏感觉[4]。5-HT通过激活5-HT1R启动蠕动反射,在此基础上5-HT4R可促进肠道头端兴奋性神经元释放乙酰胆碱和P物质,导致平滑肌收缩,促进尾端抑制性神经元释放血管活性肠肽(VIP)和一氧化氮(NO)等,导致肠道壁舒张,最终促进肠道蠕动[5]。5-HT4R还介导结肠氯离子分泌,所以,5-HT的异常可直接导致大便性状的改变。研究还发现肠道5-HT4R也参与内脏感觉信息的传递[6]。

　　对于5-HT4R的研究多集中在5-HT4R调节剂的药物疗效上,而IBS过程5-HT4R受体本身表达的变化鲜有报道。本实验结果表明,IBS模型组大鼠结肠组织5-HT4R表达水平比对照组显著降低,提示5-HT4R表达异常与IBS有关。前期研究工作还发现,IBS大鼠分泌5-HT的EC细胞数目增加且功能活跃,胞内5-HT合成限速酶TPH1表达水平也升高,使人联想可能与EC细胞5-HT4R的前膜受体功能异常有关,IBS大鼠结肠EC细胞膜5-HT4R对于结肠高水平5-HT的敏感性减弱似脱敏,可能是结肠EC细胞5-HT合成功能活跃,并导致5-HT水平升高的重要原因之一。眼针治疗后结肠组织5-HT4R表达水平比模型组显著升高,表明眼针治疗能够有效改善IBS大鼠5-HT4R表达水平,使5-HT4R功能状态恢复至正常水平,进而通过调节EC细胞功能使结肠5-HT恢复至正常水平,这可能是眼针治疗IBS的重要机制之一。

　　【参考文献】

　　[1] Katz R, Roth K, Carroll B. Acute and chronic stress effects on open field activity in the rat：Implications for a model of depression[J]. Neurosci Biobehav Rev,1981,5：247.

　　[2] Fiorica-Howells E, Liu MT, Ponimaskin EG, et al. Distribution of 5-HT4 receptors in wild-type mice and analysis of intestinal motility in 5-HT4 knockout mice[J]. Gastroenetology,2003,124：A342.

　　[3] Michael D, Gershon MD. Nerves, reflexes, and the enteric nervous system：pathogenesis of the irritable bowel syndrome[J]. J Clin Gastroenterol,2005,39(5 Suppl 3)：S184-S193.

　　[4] 李天津,余保平.5-羟色胺3、4受体与胃肠运动及临床意义[J].国外医学·消化系疾病分册,2004,24(6)：354-357.

　　[5] Baker DE. Rationale for using serotonergic agents to treat irritable bowel syndrome[J]. Am J Health Syst Pharm,2005,62(7)：700-711.

　　[6] 王静,诸琦.5-羟色胺受体及转运体在肠易激综合征发病机制中的作用[J].上海交通大学学报(医学版),2008,28(8)：1051-1054.