短发夹状RNA 对GRP78基因在结直肠癌RKO细胞中表达的抑制作用

　　【摘要】 目的 探讨短发夹状RNA对糖调节蛋白78(GRP78)在结直肠癌RKO细胞中表达抑制作用。方法以脂质体Lipofectamine 2000介导GRP78短发卡状RNA(shRNAGRP78)质粒表达载体转染RKO细胞,G418筛选得到稳定表达株, 半定量RTPCR和Western blooting方法检测GRP78 mRNA和蛋白水平变化。结果转染成功并筛选出稳定表达RKO细胞株。与对照组相比,shRNAGRP78转染RKO细胞GRP78的mRNA及蛋白水平均显著下降(t=7.079、7.510,P<0.05)。结论 shRNAGRP78能明显抑制RKO细胞GRP78 mRNA及蛋白的表达,为进一步在体内外研究GRP78在结直肠癌中的作用奠定了基础。

　　【关键词】 葡萄糖调节蛋白78;结直肠肿瘤;RNA干扰

　　DEPRESSANT EFFECT OF SHORT HAIRPIN RNA ON GRP78 EXPRESSION OF RKO CELLS IN COLORECTAL CARCINOMA WANG LILI, XING XIAOMING, LI YUJUN (Department of Pathology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China); [ABSTRACT] Objective To explore the supression of glucoseregulated protein 78 (GRP78) expression in human colorectal carcinoma cells RKO by short hairpin RNA (shRNA) interference. Methods The shRNA plasmid expression vector (shRNAGRP78) was transfected into cells with Lipofectamine 2000. After selection with G418, the stable cell clones were attained. GRP78 expression was assayed with realtime quantitative PCR and Western blotting at both mRNA and protein levels. ResultsThe transfection was successful and stable RKO cell clones with shRNAGRP78 plasmid were obtained. Compared with the control, the shRNAGRP78 plasmid caused significant reduction of GRP78 expression at mRNA and protein levels (t=7.079,7.510;P<0.01). Conclusion The shRNAGRP78 plasmid can significantly inhibit the expressions of GRP78 mRNA and protein levels, which establishes a foundation for further study, in vivo and in vitro, of the role of GRP78 in colorectal carcinoma.

　　[KEY WORDS] glucoseregulated protein 78; colorectal neoplasms; RNA interference

　　糖调节蛋白78(GRP78)，也称免疫球蛋白重链结合蛋白，是位于内质网上重要的分子伴侣，属于热休克蛋白70(Hsp70)家族成员[1]。GRP78的功能很多,作为一种分子伴侣参与蛋白质的折叠和转运,也是内质网上的一种应激蛋白,在葡萄糖缺乏、低氧和低钙等应激条件作用下,产生内质网应激反应,诱导GRP78过表达，以维持内质网的稳定。近年来研究结果表明，GRP78在多种人类肿瘤组织中高表达，并对肿瘤增殖、血管生成等有重要意义[24]。本研究拟构建GRP78靶向短发卡状RNA(shRNA)质粒表达载体(shRNAGRP78)，并采用脂质体Lipofectamine 2000转染到结直肠癌RKO细胞中，观察其对结直肠癌RKO细胞GRP78 mRNA及蛋白表达的影响，以期为结直肠癌的基因治疗提供理论依据。现将结果报告如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料与试剂

　　人结直肠癌RKO细胞系由浙江大学医学院分子病理学实验室馈赠。RPMI 1640培养基、OptiMEMI优化培养基及新生牛血清购自Gibco公司;脂质体Lipofectamin 2000及TRIzol试剂均购自Invitrogen公司;山羊抗人GRP78多抗购自Santa Cruz公司;IRDye800 标记的二抗购自Gene公司;GRP78的shRNA质粒表达载体套装试剂盒购自上海吉玛公司,其RNA干扰的靶序列为5′GCGCATTGATACTAGAAATGA3′,并命名为PGPU6/GFP/NeoGRP78(shRNAGRP78),阴性对照质粒(PGPU6/GFP/NeoshNC)由试剂盒提供。

　　1.2 细胞培养和转染

　　RKO细胞培养于含有体积分数0.10新生牛血清的RPMI 1640培养液中,置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的饱和湿度条件下培养。当细胞生长接近80%融合时,用2 g/L的胰蛋白酶消化传代。实验分为3组:①空白对照组,不加任何转染试剂;②阴性对照组,所携带的RNA干扰序列不与人任何基因的序列同源;③实验组(shRNAGRP78)。实验组及阴性对照组均采用脂质体Lipofectamine 2000介导转染法。取对数生长期细胞,按每孔8×105的细胞密度接种6孔板，24 h左右转染，按质粒(μg)∶脂质体(μL)=1∶2.5 的比例进行转染。转染步骤参照脂质体Lipofectamine 2000说明书进行。质粒和脂质体分别用 OptiMEMI培养液稀释, 室温下孵育20 min, 加入待转染的细胞中，转染8 h后,培养液更换为完全培养液, 继续培养24 h后,加入浓度为1 500 g/L的 G418进行药物筛选,倒置荧光显微镜下观察至空白对照组细胞全部死亡时停用G418，约筛选2周左右,继续培养转染成功的细胞。

　　1.3 RTPCR检测3组细胞GRP78 mRNA表达

　　分别收集3组RKO细胞，采用TRIzol一步法提取细胞总RNA,逆转录得到cDNA后行PCR反应。GRP78引物正义序列:5′GACATCAAGTTCTTGCCGTT3′;反义序列：5′CTCATAACATTTAGGCCAGC3′。内参GAPDH正义序列：5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′，反义序列：5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′。反应参数为：94 ℃ 5 min, 94 ℃ 30 s,58 ℃ 30,72 ℃ 30 s,35个循环;最后72 ℃ 5 min。取PCR产物5 μL在15 g/L琼脂糖凝胶上电泳(120V，30 min),采用Kodak DC 290凝胶成像系统分析结果。采用Kodak1D1图像分析软件分析3组的GRP78和GPADH扩增产物带的净像素值, 并计算GRP78基因相对表达水平。GRP78基因相对表达水平=GRP78的净像素值/GAPDH的净像素值。

　　1.4 Western blotting方法检测3组RKO细胞GRP78蛋白的表达

　　分别常规收集3组细胞，提取细胞总蛋白，采用BRADFORD法对3组蛋白进行定量检测。3组蛋白各取20 μg在SDSPAGE凝胶上电泳,电泳完成后转膜;以50 g/L脱脂奶粉TBST封闭液封闭3 h;抗GRP78抗体或抗βactin抗体(稀释度分别为1∶200及1∶5 000)4 ℃孵育过夜,TBST洗膜5 min，共3次;加相应IRDye800标记的二抗(稀释度为1∶5 000)室温孵育1 h;TBST洗膜5 min，共3次;最后，采用Odyssey双色红外线激光成像系统进行检测。

　　1.5 统计学处理

　　采用SPSS 13.0软件包对数据进行处理，数据以±s表示，统计处理采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 半定量RTPCR检测

　　空白对照组、阴性对照组以及实验组GRP78 mRNA相对表达量分别为(23.43±0.22)×10-2、(22.31±0.40)×10-2与(5.05±0.21)×10-2。空白对照组和阴性对照组GRP78 mRNA的相对表达量比较差异无显著性,阴性对照组与实验组GRP78 mRNA相对表达量比较差异有显著性(t=7.079,P<0.01)。

　　2.2 Western blotting方法检测

　　空白对照组、阴性对照组以及实验组中GRP78蛋白的相对表达量分别为(59.44±2.10)×10-2、(52.84±1.51)×10-2与(8.33±0.53)×10-2;空白对照组和阴性对照组GRP78的蛋白相对表达量比较差异无显著性,阴性对照组与实验组GRP78的蛋白相对表达量比较差异有显著意义(t=7.510,P<0.05)。

　　3 讨 论

　　GRP78是内质网驻留蛋白，在许多生物物种中高度保守，是Hsp70家族的成员之一[1]。GRP78可以阻止内质网新生肽聚集，参与未折叠蛋白反应调控，参与内质网钙稳态的调节及抗内质网相关性细胞凋亡等细胞生命过程[5]。GRP78表达升高能转移内质网腔内的错误折叠蛋白,保持细胞在应激状态下蛋白质合成的继续，维持内质网Ca2+稳态，对抗氧化应激，从而减轻内质网应激，保护细胞[6]。

　　肿瘤形成及实体肿瘤微环境变化(如低糖血症、低pH值和低氧血症等),可作为诱导因素导致内质网应激,诱导GRP78的过度表达。关于GRP78在癌组织中表达升高的具体机制尚未明确，可能涉及UPR、PKC、PKA、Akt及ERK等信号传导通路的激活[2,4]。刘芳等[7]研究显示，GRP78在结直肠癌组织呈高表达。因此，为明确GRP78在结直肠癌组织表达升高的机制，本文采用RAN干扰(RNAi)技术抑制其在大肠癌RKO细胞中的表达，以期为今后的研究奠定基础。

　　RNAi现象是由与靶基因序列同源双链RNA(dsRNA)引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21～25个核苷酸组成的小干扰RNA (siRNA)，随后siRNA作为介导子特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达[8]。 2001年，ELBASHIR等[9]首次发现了哺乳动物细胞也存在RNAi现象。这一发现极大地推动了RNAi技术在疾病治疗领域的研究和应用，同时也为RNAi技术广泛应用于基因治疗奠定了基础。RNAi技术较传统的转染实验简单、快速、重复性好，克服了转染实验中重组蛋白特异性聚集和转染效率不高的缺点，已被广泛应用于人类肿瘤的研究。

　　目前有多种合成 siRNA分子的方法，如化学合成法、体外转录法以及用RNA酶消化长片段双链RNA制备siRNA等，上述3种方法均为体外合成siRNA,不宜用于长期基因沉默的研究。本实验选用了含新霉素抗性基因和GFP绿色荧光标记的PGPU6/GFP/Neo载体。另外，将shRNA表达载体导入细胞中是诱导 RNAi 发生的关键, 本实验采用最常用脂质体转染法，以shRNAGRP78质粒表达载体抑制GRP78在RKO细胞中的表达，结果显示,与干扰前相比，干扰后GRP78 mRNA 和蛋白的表达明显降低，表明本实验构建的靶向shRNA质粒表达载体shRNAGRP78能够有效且稳定地抑制RKO细胞中GRP78 mRNA和蛋白的表达，为进一步实验奠定了基础。

　　总之，本研究通过 RNA干扰方法并经药物筛选得到的稳定低表达GRP78基因的RKO细胞,为进一步在体内外研究GRP78在结直肠癌中的作用奠定了基础。

　　【参考文献】

　　[1]MUNRO S, PELHAM H R. An Hsp70like protein in the ER: identity with the 78 kd glucoseregulated protein and immunoglobulin heavy chain binding protein[J]. Cell, 1986,46:291300.

　　[2]FU Y, WEY S, WANG M, et al. Pten null prostate tumorigenesis and AKT activation are blocked by targeted knockout of ER chaperone GRP78/Bip in prostate epithelium[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008,105:1944419449.

　　[3]DONG D, NI M, LI J, et al. Critical role of the stress chaperone GRP78/Bip in tumor proliferation, survival and tumor angiogenesis in transgene induced mammary tumor development[J]. Cancer Res, 2008,68:498505.

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　　[7]刘芳,邢晓明,李玉军,等. 结直肠腺癌组织Grp78表达及意义[J]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(3)：252254.

　　[8]HUPPI K, MARTIN S E, CAPIEN N J. Defining and assaying RNAi in mammalian cells[J]. Mol Cell, 2005,17:110.

　　[9]ELBASHIR S M, HARBORTH J, LENDERCKLE W, et al. Duplexes of 21nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J]. Nature, 2001,411:494498.