结缔组织生长因子在病理性瘢痕中的表达

　　【摘要】 目的 探讨结缔组织生长因子(CTGF)在病理性瘢痕形成中的作用。方法 采用半定量逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测10例瘢痕疙瘩(瘢痕疙瘩组)和10例增生性瘢痕(增生性瘢痕组)中的CTGF mRNA的表达，并以8例正常皮肤(正常皮肤组)作为对照。结果 病理性瘢痕中CTGF mRNA表达均明显高于正常皮肤组(P<0.05)，而瘢痕疙瘩组又高于增生瘢痕组(P<0.05)。结论 CTGF在病理性瘢痕的形成过程中起到重要作用。

　　【关键词】 瘢痕疙瘩;增生性瘢痕;结缔组织生长因子

　　Expression of connective tissue growth factor in pathological scar

　　TAO Changbo, JIN Peisheng, ZHANG Aijun, LI Xueyang

　　Department of Plastic Surgery, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou， Jiangsu 221002, China

　　Abstract:Objective To explore the effect of connective tissue growth factor (CTGF) in the pathogenesis of pathological scar.Methods Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the expression of CTGF mRNA in 10 cases of keloid (keloid group), 10 cases of hypertrophic scar (hypertrophic scar) and 8 cases of normal skin (normal control group).Results Compared with normal control group, CTGF mRNA was over-expressed in pathological scar group (P<0.05), and the expression of CTGF mRNA was higher in keloid group than in hypertrophic scar group (P<0.05).Conclusions CTGF may play an important role in the pathogenesis of pathological scar.

　　Key words： keloid; hypertrophic scar; connective tissue growth factor

　　瘢痕疙瘩和增生性瘢痕是临床常见的病理性瘢痕，也是整形外科较难解决的临床问题，目前其发病机制尚不清楚。研究发现，病理性瘢痕是以成纤维细胞为主的细胞成分过度增生以及以胶原为主的细胞外基质过度沉积构成，当前普遍认为转化生长因子-β1(TGF-β1)是促进纤维化的重要生长因子之一，在瘢痕的形成过程中起着核心的作用[1]，而结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)是一种由成纤维细胞在TGF-β1刺激下产生的生长因子，具有强烈的刺激成纤维细胞增殖和促进胶原沉积的作用，作为TGF-β1的重要下游介质[2],在各种纤维化疾病中发挥着重要作用。我们应用RT-PCR技术在核酸水平检测CTGF在病理性瘢痕中的表达情况，探讨CTGF在瘢痕中的作用，为探求病理性瘢痕的成因寻求一定的实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 标本来源和分组

　　实验标本均来源于徐州医学院附属医院整形外科，所有标本选取前均未进行过任何放疗、药物注射、外用药物治疗。患者均无系统性疾病，瘢痕表面无破溃、感染。分组：①瘢痕疙瘩组10例，年龄8～42岁，平均20.4岁。病变部位包括胸前、上臂、耳垂、上背部。②增生性瘢痕组10例，年龄3～36岁，平均18.2岁。病变部位包括前胸、下腹、颈部、四肢。③正常皮肤组8例，年龄6～50岁，平均23.5岁。为其他整形手术切除的正常皮肤标本。

　　1.2 标本采集

　　切取标本时均在无菌条件下进行，去除皮下脂肪组织及表皮，放入事先标记好序号的冻融管，立即投入液氮速冻，然后转移至-70℃冰箱保存备用。

　　1.3 试剂与设备

　　TRNzol试剂(北京天根公司);RNA PCR试剂盒(杭州博日科技有限公司);电动匀浆器 (美国 Homogehizer公司);Eppendorf-5840R台式冷冻离心机(德国Eppendorf公司);PCR扩增仪PTC-100(美国MJResearch公司);电脑三恒多用电泳仪(北京六一仪器厂);凝胶成像系统INGENIUS (美国基因有限公司)。

　　1.4 实验方法

　　1.4.1 引物准备

　　参照人CTGF cDNA序列，进行特异性CTGF引物设计，同时选取β-actin作为内参照。CTGF序列：上游5'-AAC TAT GAT TAG AGC CAA CTG CCT G-3'，下游5'-TCA TGC CAT GTC TCC GTA CAT CTT C-3',扩增片段长度为475 bp，β-actin：上游 5'-CCG CGA GAA GAT GAC CCA GAT-3'，下游5'-GAA GCA TTT GCG GTG GAC GA-3' 用这对引物可扩增β-actin cDNA片段长度为781 bp。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

　　1.4.2 组织总RNA提取

　　取标本组织50 mg，剪碎后加入1 ml TRNzol试剂，电动组织匀浆器匀浆，其后操作步骤按照试剂说明书进行。抽提的总RNA测D260 nm 和D280 nm，并计算比值为1.6～2.0，余下RNA加入30～100 μl 不含RNA酶的双蒸水, -70℃冰箱保存备用。

　　1.4.3 逆转录(RT)

　　反应总体积10 μl，RNA模板1 μl (2 μg), RNA酶抑制剂0.5 μl，5×RT Buffer 2 μl ,10 mmol/L dNTP 1 μl ,随机引物0.5 μl，逆转录酶0.5 μl，不含RNA酶的双蒸水4.5 μl。按以下条件进行逆转录反应:室温10 min，45℃ 45 min，95℃ 5 min，4℃ 5 min。cDNA -20℃保存或直接扩增。

　　1.4.4 PCR扩增

　　按以下条件配制反应液：10×PCR Buffer 2.5 μl, 10 mmol/L dNTP 混合物0.5 μl, 5 μmol/L CTGF上游及下游特异性引物各0.5 μl,Tap mix DNA聚合酶0.5 μl，RT产物2.5 μl,加不含RNA酶的双蒸水18 μl至总体积25 μl。按以下条件进行PCR反应：94℃预变性3 min,然后94℃ 30 s,65℃ 30 s,72℃ 7 min, 72℃ 5 min,循环30次，末次延伸72℃ 5 min。

　　1.4.5 结果分析

　　取10 μl PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳(电压8 V/cm), 溴化乙啶(EB)染色，以β-actin为内参照，设定值为1，经凝胶成像分析系统分析其灰度值并计算比值。

　　1.5 统计学处理

　　采用SPSS 13.0统计分析软件进行统计学处理，数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，采用q检验进行两两比较，P<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 PCR产物结果

　　3组PCR扩增产物经电泳分离并在紫外灯下观察，可见到位于781 bp和475 bp处各有1条特异性条带，与预期扩增片段长度相符。电泳结果见图1。

　　2.2 各组间CTGF mRNA表达量(相对于β-actin)的比较

　　瘢痕疙瘩组与增生性瘢痕组CTGF mRNA表达量均明显高于正常皮肤组(P<0.05)，而瘢痕疙瘩组表达量又高于增生性瘢痕组(P<0.05)。见表1。表1 3组间CTGF mRNA表达量的比较(略)

　　3 讨 论

　　CTGF是1991年Bradham等[3]用亲和色谱法在人体脐静脉内皮细胞的条件培养基中发现的，是一种富含半胱氨酸的多肽。在其他种属的动物如猪、牛、蛙等体内亦存在，在人体多种组织器官如心、肝、肾、动脉和脑中广泛存在。内皮细胞、软骨细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞及某些肿瘤细胞均可表达CTGF[4]。根据靶细胞的不同，CTGF可以发挥不同的作用：①促进细胞外基质合成[5];②促进血管的形成[6];③促进细胞凋亡[7];④刺激成纤维细胞生长[8]。

　　3.1 病理性瘢痕中CTGF高表达的意义

　　人体皮肤成纤维细胞具有较强的CTGF表达潜能，正常状态下不表达或表达极少。CTGF作为TGF-β1的下游反应介质， 当应用TGF-β1刺激后，CTGF表达明显上调，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的成纤维细胞释放的CTGF可以在TGF-β1刺激下表达增加150倍[9]。Igarashi等[10]和刘剑毅等[11]研究均发现瘢痕疙瘩中有广泛分布的CTGF ，瘢痕的增生程度越明显，CTGF的表达程度越高。本研究结果显示，普通瘢痕纤维组织中CTGF含量低于瘢痕疙瘩，而正常皮肤中CTGF表达很少或不表达。由此可推测，病理性瘢痕形成过程中CTGF在TGF-β1的作用下高水平表达，进而翻译成蛋白质，刺激组织成纤维细胞增殖和以胶原为主的细胞外基质的沉积，而增殖的成纤维细胞继续分泌CTGF，从而促进瘢痕组织的不断增生。这一点也解释了临床上瘢痕疙瘩为什么可以持续生长，并能不断向周围正常组织扩展，同时也为从核酸和蛋白质水平治疗瘢痕提供了依据。

　　3.2 CTGF在病理性瘢痕治疗中的展望

　　增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的病因、发病机制到目前为止尚不清楚。以往的实验研究表明，在各种纤维化的疾病中TGF-β和CTGF都同步增高。TGF-β一直以来被认为是促进纤维化的重要生长因子，但是由于 TGF-β生物学效应的多样化，作用的靶细胞种类较多，除可促进纤维化外，尚参与机体的抗炎、调控细胞分化、调节免疫等，如果阻断 TGF-β的表达，将可能引起细胞生长失控、免疫失调、严重炎症等不良反应[12]。本研究结果表明，CTGF作为 TGF-β的下游反应介质，在病理性瘢痕的形成中起到一个重要的促纤维化作用。相比之下，CTGF 的作用较为单一，主要作用于成纤维细胞而不影响上皮细胞和免疫细胞[13]。如果可以单纯阻断 CTGF的表达或抑制其生物活性，既可以减轻TGF-β的促纤维化作用，又可以保留TGF-β有利的抗炎、抗肿瘤和调节免疫作用，这将可能成为一种安全、高效且特异性强的抑制纤维化的方法，在将来的瘢痕防治中将会发挥令人瞩目的作用。目前针对CTGF为靶点治疗病理性瘢痕尚未见报道，如何阻断CTGF的表达或抑制其生物活性，有待于进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1]Border WA, Noble NA. Transforming growth factor beta in tissue fibrosis [J]. N Engl J Med, 1994, 331 (19): 1286-1292.

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　　[3]Bradham DM, Igarashi A, Potter RL. Connective tissue growth factor: a cystine-rich mitogen secreted by human vascular endothelial cells is related to the SRC-induced immediate early gene product CEF-10 [J]. J Cell Biol, 1991, 114 (6):1285-1294.

　　[4]Chaqour B, Goppelt-Struebe M. Mechanical regulation of the Cyr 61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins [J]. FEBS J, 2006, 273(16): 3639-3649.

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　　[6]Shimo T， Nakaishi T, Nishida T, et al. Connective tissue growth factor induces the proliferation, migration, and tube formation of vascular endothelial cells in vitro, and angiogenesis in vivo [J]. J Biochem, 1999, 126(1):137-145.

　　[7]Rodriguez-Vita J, Ruiz-Ortega M, Rupérez M, et al. Endothelin-1, via ETA receptor and independently of transforming growth factor-β, increases the connective tissue growth factor in vascular smooth muscle cells [J]. Circ Res, 2005, 97(2):125-134.

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