下丘脑室旁核微量注射ghrelin经迷走神经增强清醒大鼠胃运动及胃电活动

　　【摘要】 目的 探讨下丘脑室旁核(paraventricular nucleus，PVN)内微量注射ghrelin对清醒大鼠胃运动及胃电活动的影响及其自主神经机制。方法 采用核团内微量注射药物、应力传感器引导胃运动及银丝电极同步记录胃电活动等方法。结果 PVN注射0.15、0.3 nmol ghrelin后，胃运动及胃电幅度呈剂量依赖性增强(P<0.01)，0.3 nmol ghrelin组胃运动及胃电快波和慢波的幅度变化率分别为(68.76±17.00)%、(57.04±17.10)%、(63.20±19.59)%;药物剂量对胃运动频率无明显影响。膈下迷走神经切断或静脉注射阿托品(0.5 mg/kg)可完全消除PVN内ghrelin增强胃运动及胃电活动的效应(P<0.01)，而交感神经节摘除或静脉注射酚妥拉明(2 mg/kg)或心得安(5 mg/kg)则不影响该效应。结论 PVN内微量注射ghrelin可增强清醒大鼠胃运动及胃电活动，这种作用在外周通过迷走神经胆碱能通路介导，而与交感神经关系不大。

　　【关键词】 ghrelin;室旁核;胃运动;胃电活动;迷走神经;交感神经

　　Ghrelin microinjected into hypothalamic paraventricular nucleus stimulates gastric motility and elecctrical activity mediated by vagus nerve in conscious rats

　　WANG Guangming, ZHANG Jianfu, QIAO Weili, ZHANG Yongmei, ZHU Liyan

　　Department of Physiology, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China;2. Neurobiology Research Center, Xuzhou Medical College

　　Abstract: Objective To investigate the effects of microinjection of exogenous ghrelin into the hypothalamic paraventricular nucleus (PVN) on gastric motility and electrical activity in ambulant conscious rats and their peripheral neural mechanisms. Methods Ghrelin was microinjected into PVN in rats and the antral motility and electrical activity were measured by extraluminal force strain gage transducers and electrodes. Results The amplitudes of gastric motility and electrical activity dose-dependently increased after administration of ghrelin (0.15, 0.3 nmol) into PVN (P<0.01). In 0.3 nmol group, the amplitudes of gastric motility, fast wave and slow wave increased by (68.76±17.00)%, (57.04±17.10)% and (63.20±19.59)%, respectively. Pretreatment of subdiaphragmatic vagotomy or intravenous injection of atropine (0.5 mg/kg) completely abolished the effects of ghrelin (P<0.01), but no effect was observed following sympathectomy or intravenous injection of propranolol (5 mg/kg) or phentolamine (2 mg/kg). Conclusion Exogenous ghrelin in PVN stimulates gastric motility and electrical activity in conscious rats, which seems to be mediated by the vagal cholinergic fibers, whereas the sympathetic nerves may not be involved in the pathway.

　　Key words: ghrelin; paraventricular nucleus; gastric motility; gastric electrical activity; vagus nerves; sympathetic nerves

　　作为一种新发现的脑肠肽，ghrelin是促生长激素分泌受体(growth-hormone secretagogue receptor , GHS-R)的内源性配体，存在于胃内分泌细胞、下丘脑、腺垂体、脑干以及心脏等外周组织 [1]。GHS-R广泛分布于脑及外周组织。在鼠脑，GHS-R主要位于腺垂体及下丘脑多个核团如室旁核(PVN)、弓状核等[2]。Ghrelin与GHS-R结合后会产生一系列生物学效应，如刺激生长激素释放、增加食欲、调节能量代谢等。

　　Ghrelin对胃运动、胃电活动的调控则报道较少。外周或侧脑室给予ghrelin可增强胃十二指肠动力[3-5]。但目前尚缺乏神经核团内ghrelin对胃功能活动调控的资料。PVN是调控胃功能的重要核团，ghrelin及其受体GHS-R在PVN内的大量分布，提示PVN内ghrelin对胃功能的调节可能具有重要作用。为此，我们采用核团微量注射、应力传感器引导胃运动及银丝电极引导胃电等方法，观察了PVN内ghrelin对清醒大鼠胃运动及胃电活动的影响，并就其作用的自主神经机制进行初步探讨。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物和药品

　　选用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠，体重250～350 g，由徐州医学院实验动物中心提供。Ghrelin，心得安(Sigma Co.USA);硫酸阿托品(上海第十制药厂);酚妥拉明(Ciba-Geigy Limited Basle , Switzerland)。

　　1.2 动物模型制备

　　1.2.1 应力传感器及银丝电极的置入

　　大鼠术前禁食18 h，自由饮水。8%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，消毒条件下开腹，距幽门0.3 cm处沿环行肌方向分别将应力传感器及双极银丝电极缝贴于胃窦腹侧面和背侧面浆膜，导线经皮下引至颈部固定。

　　1.2.2 核团置管

　　在脑立体定位仪引导下，参照Paxinos-Watson大鼠脑立体定位图谱，无菌条件下置不锈钢套管(长25 mm，外径0.7 mm，内径0.4 mm)于一侧PVN(前囟后1.5～1.8 mm，旁开0.2～0.4 mm，颅骨表面下5.9～6.3 mm，门齿根部低于耳间线3.3 mm)，以针灸针(长25 mm，直径0.35 mm)为套管内芯，用502胶、牙托粉、牙托水及细铜丝固定。

　　1.2.3 颈静脉插管

　　消毒条件下于右颈静脉植入插管，内充肝素(1×105 U/L),导管经皮下引至颈部固定。

　　1.2.4 膈下迷走神经切断及腹腔交感神经节摘除

　　开腹后，在距贲门5 mm处的食管前后壁，切断迷走神经前、后支。在腹腔动脉、腹主动脉及肠系膜上动脉之间可见灰白色的交感神经节，用有齿眼科镊钝性分离并去除之。假手术组仅开腹后暴露迷走神经或交感神经节。

　　1.2.5 术后处理

　　术后动物单独喂养，每天腹腔给予青霉素8万U预防感染，术后3～5天动物恢复、饮食正常后进行实验观察。

　　1.3 胃运动和胃电活动的记录

　　大鼠禁食18 h，自由饮水。将清醒动物置于特制鼠笼内，将应力传感器及银丝电极导线分别连接于ML110桥式放大器和ML132生物电放大器，通过MacLab生物信号记录系统(AD Instrument Pty Ltd. Australia)记录胃运动、胃电活动(胃运动：量程1 mV、滤波20 Hz。胃电快波：时间常数0.03 s、滤波30 Hz。胃电慢波：时间常数1 s、滤波10 Hz)。

　　1.4 核团内微量注射

　　微量注射器以硅胶管与不锈钢内套管相连(外径0.30 mm，长度27 mm)，吸取待注射药物后将内套管轻插入外套管，其尖端伸出2 mm进入核团，3 min内缓慢注射完毕，留针3 min。

　　1.5 实验分组

　　所有动物均随机分组，按以下步骤进行实验观察。①同步记录5只大鼠胃运动和胃电活动1 h，观察正常胃运动及胃电活动。②大鼠分为5组，每组5～7只：实验组(4组)PVN内分别微量注射ghrelin 0.03、0.06、0.15、0.3 nmol各0.5 μl，对照组PVN微量注射生理盐水0.5 μl。③大鼠分为4组，每组5只：迷走神经假切断组、迷走神经切断组、交感神经节假摘除组、交感神经节摘除组。每组均于PVN内微量注射ghrelin 0.3 nmol/ 0.5 μl。④大鼠随机分为4组，每组5～6只：分别经颈静脉注射0.5 ml生理盐水、阿托品(0.5 mg/kg)、心得安(5 mg/kg)及酚妥拉明(2 mg/kg)，3 min后PVN内微量注射ghrelin(0.3 nmol/0.5 μl)。

　　1.6 组织学鉴定

　　实验结束后，经套管向PVN内注入0.5 μl 2%滂胺天蓝。麻醉后经左心室-升主动脉灌注固定后行50 μm连续冠状冰冻切片。采用中性红染色法，观察脑片内套管轨迹，确定注射部位，定位不准者弃去不用。

　　1.7 统计学处理

　　利用MacLab系统的Chart软件，计算注射药物前后10 min的胃运动及胃电(包括快波、慢波)幅度或频率的变化率。公式为：

　　给药后幅度或频率-给药前幅度或频率给药前幅度或频率×100%

　　实验数据以±s表示，采用SPSS 13.0进行统计学分析。多组间比较采用完全随机设计方差分析方法(ANOVA)，多个实验组与一个对照组比较用最小显著差法(LSD)，多个实验组之间比较用q检验(Newman-Keuls test);两组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 正常大鼠胃运动及胃电活动

　　正常清醒大鼠胃运动幅度为(8.25±2.93)g，频率为(4.98±0.43)Hz;胃电快波幅度为(84.06±27.29)μV，胃电慢波幅度为(0.44±0.13)mV，胃电的频率同胃运动一致。胃电慢波呈双相，胃电快波成簇出现，负载于慢波之上;胃运动与胃电活动具有同步关系，胃运动在时程上约出现在胃电活动后2 s。

　　2.2 PVN内微量注射ghrelin对大鼠胃运动及胃电活动的影响

　　PVN分别微量注射ghrelin 0.03、0.06 nmol后，胃窦运动幅度及胃电快波和慢波的幅度有轻度增加趋势，但与对照组相比无统计学意义(P>0.05);而PVN注射0.15、0.3 nmol ghrelin后，胃运动及胃电幅度呈剂量依赖性增强，且以0.3 nmol组最为显著(P<0.01)，胃运动及胃电快波和慢波的幅度变化率分别为(68.76±17.00)%、(57.04±17.10)%、(63.20±19.59)%;药物剂量对胃运动频率无明显影响(P>0.05)(图1、2) 。

　　2.3 迷走、交感神经在PVN内注射ghrelin对大鼠胃运动及胃电活动调控中的作用

　　在迷走神经假切断组，PVN注射0.3 nmol ghrelin后，胃运动及胃电快波和慢波的幅度分别增强了(60.62±20.14)%、(51.40±14.66)%、(42.30±11.11)%;迷走神经切断后，该效应被完全消除(P<0.01)，胃运动及胃电的幅度变化率降至(5.50±8.49)%、(3.46±8.23)%、(5.26±9.17)%。然而，交感神经节摘除并不能阻断PVN注射ghrelin对胃运动及胃电活动的兴奋效应(P>0.05)(图3)。

　　2.4 颈静脉注射外周受体阻断剂后，PVN内注射ghrelin对大鼠胃运动及胃电活动的影响

　　经颈静脉注射生理盐水后，PVN微量注射ghrelin 0.3 nmol，胃运动和胃电幅度明显增强。经颈静脉分别注射心得安、酚妥拉明后并不能阻断该效应(P>0.05);而经颈静脉注射阿托品后，PVN微量注射ghrelin后并不能引起胃运动及胃电幅度的增强，而是降至(-30.42±6.72)%、(-23.10±7.94)%、(-20.70±6.87)%(图4)。

　　3 讨 论

　　胃电慢波是在静息膜电位基础上发生的缓慢自动除极的节律性传导波，决定胃平滑肌的收缩节律;胃电快波即胃平滑肌的动作电位，发生在慢波的基础上，可触发平滑肌的收缩，其振幅和时程与胃运动的幅度和时程呈正相关[6]。本实验观察到，胃窦蠕动波的频率与胃电慢波节律一致，胃电快波成簇发生，负载于每个慢波之上，胃运动幅度及胃电快、慢波幅度同步变化，胃电活动的增强可引起胃运动的增强。

　　PVN对生理及应激状态下的胃酸分泌、胃运动、胃电活动和各种病因所致的胃黏膜损伤具有广泛的调节作用。Ghrelin及其受体GHS-R在PVN内的大量分布，提示PVN内ghrelin对胃功能的调节可能具有重要的作用。最近的资料发现腹腔注射ghrelin 在使大鼠摄食增加的同时，可使PVN中c-Fos蛋白表达增强[7];PVN内微量注射ghrelin使大鼠摄食增加[8]; ghrelin和胃动素具高度结构同源性[9]，而PVN内注射胃动素可增强大鼠胃运动[10]。这些均提示我们，ghrelin可否作用于PVN而影响胃运动和胃电活动?

　　我们观察到，PVN内注射0.15、0.3 nmol ghrelin后，胃运动和胃电(包括快波、慢波)幅度呈剂量依赖性增强。这表明PVN内ghrelin对胃运动和胃电活动具有兴奋性作用。Gherlin的受体GHS-R是一种G蛋白耦联受体，分为Ia和Ib两型。在鼠脑，GHS1a-R除了腺垂体，主要分布下丘脑的多个核团，PVN是GHS1a-R mRNA表达最密的核团之一，而GHS1b-R在脑内的分布远较GHS1a-R局限[2]。我们推测，PVN内ghrelin对胃运动及胃电活动的调控作用，可能是通过作用于PVN内神经元上的GHS1a-R而实现的。Ghrelin在血-脑屏障转运的程度和方向取决于其翻译后辛酰基化结构，ghrelin很少经血-脑屏障转运，而去辛酰基化ghrelin可一过性地通过血-脑屏障[11];并且ghrelin是一种大分子多肽，因而可以排除ghrelin通过血-脑屏障进入外周进行作用的可能。中枢内ghrelin可引起血中生长激素水平升高[12]，然而尚没有生长激素对胃运动功能调控的报道，故认为PVN内ghrelin对胃运动和胃电活动的作用可能与生长激素的分泌无关。唐明等[13]观察到，侧脑室或下丘脑腹内侧核注射胃动素可增强胃运动，而对收缩频率无影响，我们也注意到，PVN内注射ghrelin后胃运动频率无明显变化，其胃内机制有待于进一步研究。

　　我们还初步探讨了PVN内微量注射ghrelin对胃运动及胃电活动影响的外周神经机制。除肠神经系统外，胃运动及胃电活动主要受到自主神经系统的支配，包括交感神经和迷走神经。交感神经为肾上腺能纤维，末梢释放去甲肾上腺素，通过α、β受体抑制胃运动和胃电活动。迷走神经主要为胆碱能纤维，末梢释放乙酰胆碱，通过M受体使胃运动增强;此外，迷走神经还含有少量非胆碱能非肾上腺素能纤维，末梢主要释放肽类递质，对胃具有兴奋性或抑制性效应[6]。本实验观察到，交感神经节摘除或静脉分别给予肾上腺素α受体阻断剂酚妥拉明和β受体阻断剂心得安后，并不能消除PVN内微量注射ghrelin增强胃运动及胃电活动的效应，而膈下迷走神经切断或静脉给予胆碱M受体阻断剂阿托品则可完全消除PVN内注射ghrelin所引起的胃运动及胃电活动的增强。此结果提示，PVN内ghrelin对胃运动及胃电活动的作用在外周并非通过肾上腺素α、β受体介导，而是由胆碱M受体所介导。

　　我们的研究首次提出了PVN内外源性ghrelin可增强胃运动及胃电活动，该效应在外周系由迷走神经胆碱能纤维介导的，交感神经肾上腺素能系统似不参与该过程。

　　【参考文献】

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　　[2]Guan XM,Yu H, Palyha OC,et al. Distributian of mRNA encoding the growth hormone secretagogue receptor in brain and peripheral tissues [J].Braim Res Mol Brain Res,1997,48(1):23-29.

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　　[6]周吕.胃肠生理学——基础与临床[M].2版.北京：科学出版社，1998：22-342.

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　　[10]阎春玲，王守彪，蒋正尧，等. 下丘脑室旁核胃动素对胃运动