NF-κB途径在舒林酸促人胃癌SGC-7901细胞凋亡中的作用

　　【摘要】 目的 探讨核因子κB(NF-κB)途径在舒林酸促人胃癌SGC-7901细胞凋亡中的作用。方法 体外培养人胃癌SGC-7901细胞，舒林酸(0.1、0.3、0.6、1.2、2.4 mmol/L)作用后，苏木精-伊红染色、电镜观察药物作用后细胞形态学变化，免疫组化、Western-blot方法检测药物对人胃癌SGC-7901细胞核因子κB(NF-κB)、bcl-2、bax蛋白表达的影响。结果 苏木精-伊红染色检测结果显示舒林酸抑制肿瘤细胞生长，肿瘤细胞出现核固缩、核碎裂、染色质边集等凋亡及坏死的形态学表现;电镜下可看到染色质边集、凋亡小体;免疫组化、Western-blot结果显示舒林酸作用48 h后人胃癌SGC-7901细胞NF-κB、bcl-2表达逐渐下降，bax表达逐渐上升，具有剂量依赖性。NF-κB与bcl-2蛋白表达率之间具有相关性(r=0.8465，P<0.01)。结论 舒林酸可以促进人胃癌SGC-7901细胞凋亡，NF-κB途径在舒林酸促进胃癌SGC-7901细胞凋亡中发挥部分作用。

　　【关键词】 胃癌;非甾体类抗炎药;舒林酸;核因子κB;bcl-2;bax

　　The role of NF-κB pathway of sulindac-induced apoptosis in human gastric carcinoma SGC-7901 cells

　　CAI Hongxing, ZHU Zu′an, ZHU Zhengqiu

　　1. Department of Forensic Medicine, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China; 2. Department of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China;3. Department of Medical Oncology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College

　　Abstract: Objective To investigate the role of NF-κB pathway of sulindac-induced apoptosis in human gastric carcinoma SGC-7901 cells. Methods SGC-7901 cells were incubated and treated with the different concentrations of sulindac (0.1, 0.3, 0.6, 1.2, 2.4 mmol/L), and were then underwent hematoxylin-eosine (H-E) staining for observation of cytomorphological changes under the Olympus optical microscope and transmission electron microscope. Immunohistochemical method and Western-blot analysis were employed to investigate the effect of sulindac on the expression of NF-κB, bcl-2 and bax of human gastric carcinoma SGC-7901 cells. Results HE staining showed that sulindac could inhibit the growth of tumor cells, with the morphological presentations as apoptosis and necrosis including pyknosis, karyorrhexis and chromatin crescent formation, etc. By electron microscopy, cells also had apoptotic characteristics including chromatin crescent formation and apoptotic body. Immunohistochemistry and Western-blot assay results showed that 48 hours after sulindac administration, the expression of NF-κB, bcl-2 and bax gradually decreased, while the level of bax protein gradually increased, in a dose dependence manner. There was a positive correlation between the expression of NF-κB and bcl-2. Conclusion Sulindac can induce apoptosis via NF-κB pathway in gastric carcinoma cell line SGC7901.

　　Key words: gastric carcinoma; NSAIDs; sulindac; NF-κB; bcl-2; bax

　　研究表明非甾体类抗炎药(NSAIDs)可以通过对环氧化酶2(COX-2)的直接抑制作用及由此引起的前列腺素(PGs)生成减少而发挥抗肿瘤作用[1]。同时有研究表明NSAIDs可以通过核因子κB (nuclear factor-kappaB, NF-κB)、过氧化物酶体增生物激活受体γ(PPARγ)等非COX-2依赖性途径发挥抗肿瘤作用[2-3]，然而对此的研究结果并不一致。本实验旨在观察舒林酸作用于人胃癌SGC-7901细胞后NF-κB途径在其促细胞凋亡中的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料及仪器

　　舒林酸、RPMI 1640培养液购自美国Sigma公司，无支原体小牛血清购自杭州四季青生物技术材料公司。人胃癌SGC-7901细胞株购自中科院上海细胞所。NF-κB(sc-8008)、bcl-2(sc-492)、bax(sc-493)抗体均为Santa cruz公司产品，购自北京中杉试剂有限公司。舒林酸用二甲基亚砜(DMSO)溶解后配成1.2 mol/L的储备液，实验时用RPMI 1640液稀释至所需浓度。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 MTT法

　　取SGC-7901细胞接种于96孔培养板，每孔1×104个细胞，置37℃、5%CO2及饱和湿度条件下，待24 h细胞贴壁生长后，换入含有药物舒林酸的培养液，使舒林酸终浓度分别为0.1、0.3、0.6、1.2、2.4 mmol/L，并设有阴性对照组(舒林酸0 mmol/L)、阳性对照组(顺铂 10 mg/L)，每组设12个复孔，重复4板，分别培养至24、36、48、60 h时，每孔加入5 g/L的MTT液40 μl，继续培养4 h后移除培养液，加入200 μl DMSO振荡混匀，酶标仪492 nm处测定光密度(D)，计算抑制率，抑制率=(1-D给药组/D阴性对照组)×100%。

　　1.2.2 形态学观察

　　1.2.2.1 苏木精-伊红染色观察

　　将SGC-7901细胞稀释为1×108个/L，每孔5 ml接种于6孔培养板，每培养孔放置直径12 mm经多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片，置37℃、5%CO2及饱和湿度条件下，待24 h细胞贴壁生长后，吸除培养液，分别加入终浓度为0.1、0.3、0.6、1.2、2.4 mmol/L的舒林酸，设阴性对照组及阳性对照组,每组平行3个样本。通过光学显微镜观察细胞形态学改变，同时在24、36、48、60 h后将培养板中附有SGC-7901细胞的盖玻片取出，PBS冲洗，10%中性甲醛固定5 min，苏木精-伊红染色并观察形态学改变。

　　1.2.2.2 透射电镜观察

　　将SGC-7901细胞稀释为1×108个/L，按每瓶10 ml接种于50 ml培养瓶，置于37℃、5%CO2及饱和湿度条件下，24 h细胞贴壁生长后，弃培养液，加入含有舒林酸药物的培养液，使其终浓度分别为0.3、0.6、1.2 mmol/L，设立阴性对照，每组3个平行样本。继续培养48 h后取出，0.25%胰酶消化，离心收集细胞，2%戊二醛固定细胞，环氧树脂821包埋，制作超薄切片(60 nm)后醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色，透射电镜进行形态学观察。

　　1.2.3 免疫组化检测

　　将SGC-7901细胞稀释为1×108个/L，每孔5 ml接种于6孔培养板，每培养孔放置直径12 mm经多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片6片，置37℃、5%CO2及饱和湿度条件下，待24 h细胞贴壁生长后，吸除培养液，分别加入舒林酸终浓度为0.3、0.6、1.2 mmol/L 及0 mmol/L(阴性对照)的RPMI 1640培养液，每组6个平行样本。继续培养48 h取出玻片，PBS冲洗，10%中性甲醛固定5 min, 放置于37℃恒温箱2 h后取出，采用Power Vision两步法(操作步骤按试剂说明书)进行免疫组化染色,检测药物作用前后NF-κB、bcl-2、bax表达的改变。结果判定：NF-κB、bcl-2、bax皆为胞质着色，胞质出现棕色或棕褐色颗粒判断为阳性细胞，高倍镜下观察10个高倍视野，计算阳性细胞占所有细胞的比例。

　　1.2.4 Western-blot检测

　　将SGC-7901细胞稀释为1×108/L，按每瓶10 ml接种于50 ml培养瓶，培养24 h细胞附壁后，倒掉培养液，加入含有舒林酸药物的培养液，使其终浓度分别为0.3、0.6、1.2 mmol/L，并设立阴性对照，每组3个平行样本。继续培养48 h后取出，0.25%胰酶消化，离心收集细胞，PBS洗涤3次。细胞超声粉碎机粉碎细胞后收集上清作为细胞总蛋白，并用考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。取一定量的蛋白质样品与2×SDS上样缓冲液(100 mmol/L Tris碱、200 mmol/L DTT、4%SDS、0.2%溴酚蓝、20%甘油)混合，按每泳道20 μg加载于SDS-PAGE凝胶电泳样品孔中;100 V电泳至溴酚蓝达分离胶，加大电压至200 V，直至溴酚蓝达凝胶底部。半干电转移至硝酸纤维膜上，3%牛血清白蛋白封闭，分别加入1∶1000稀释的鼠抗NF-κB、兔抗bcl-2、兔抗bax抗体，4℃孵育过夜，加入二抗，室温孵育2 h，NBT/BCIP显色观察结果。

　　1.3 统计学处理

　　用Stata 10.0软件进行数据处理，数据用±s表示，2组间差异采用t检验，多样本两两比较采用Scheffe法分析组间差异，相关性分析采用Spearman等级相关检验。检验水准：α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 SGC-7901细胞生长抑制情况

　　MTT检测结果显示：舒林酸可以抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖，其抑制作用具有明显的剂量依赖性。见表1。表1 不同浓度舒林酸在不同时间对SGC-7901细胞的抑制作用(略)

　　2.2 形态学改变

　　随着给药浓度的增加及给药时间的延长，SGC-7901细胞逐渐变的稀疏，舒林酸高浓度组细胞出现核固缩、核碎裂、染色质边集等凋亡及坏死的形态学表现, 电镜下可染色质边集及凋亡的小体等凋亡的形态学表现。见图1。

　　2.3 NF-κB、bcl-2、bax表达的改变及其相关性

　　2.3.1 免疫组化结果显示舒林酸作用48 h后人胃癌SGC-7901细胞NF-κB、bcl-2表达逐渐下降，bax表达逐渐上升;舒林酸0.6、1.2 mmol/L组与阴性对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)(表2，图2)。由Western-blot结果可见，随着药物浓度的升高,NF-κB、bcl-2蛋白表达水平逐渐降低，bax表达逐渐升高(图3)。表2 舒林酸作用48 h后NF-κB、bcl-2、bax阳性细胞比例(略)

　　2.3.2 舒林酸作用于人胃癌SGC-7901细胞48 h后NF-κB、bcl-2的表达随着给药浓度的增加均逐渐下降，两者之间具有相关性(r=0.8465;P<0.01)。

　　3 讨 论

　　NF-κB为一转录因子家族，最常见的是以p50/p65异二聚体形式存在于细胞质中。正常状态下，NF-κB与其调节蛋白IκB-α结合后以非活性形式存在于细胞质中，在IκB激酶(IKK)作用下，IκB-α可发生32、36位丝氨酸磷酸化而降解，并与NF-κB分离，此时NF-κB可以转位进入细胞核内与靶基因启动子结合，迅速诱导靶基因mRNA的合成，参与感染、炎症、免疫反应的调节。近来研究表明，NF-κB还与细胞凋亡、细胞周期调控及细胞分化等肿瘤发生、浸润和转移过程存在密切关系[4-5]。在人类白血病、胃癌、肝癌、大肠癌、卵巢癌、膀胱癌等许多恶性肿瘤中NF-κB呈异常活化状态。至于其作用机制，研究显示NF-κB可以上调包括粘附分子( VCAM-I、ICAM-1、ELAM-I )、细胞外基质蛋白水解酶(uPA、MMP-2)和血管内皮生长因子(VEGF)等多种基因的表达，从而促进肿瘤浸润与转移[6-7]。NF-κB还可以通过多条途径参与肿瘤凋亡的调控，如调节bcl-2、bax、IAP家族、caspase、cyclinD等基因的表达，这些基因产物可相互协同并在早期抑制细胞凋亡，从而促进细胞无限增殖，加速肿瘤形成[8]。

　　NF-κB与细胞凋亡、细胞周期调控及细胞分化等肿瘤的发生、浸润和转移过程存在密切关系，提示其可以成为一个新的肿瘤防治靶点。诱导肿瘤细胞的凋亡在NSAIDs抗肿瘤作用中具有重要作用。对于NSAIDs的促凋亡机制至今并不十分清楚，可能与NSAIDs下调bcl-2、FACL4，上调c-myc、Par-4表达及激活caspase-3酶有关[9];但Charames等[10]采用RNA干扰技术去除HT-29结肠癌细胞内源性COX-2表达后并未发现bcl-2表达及caspase-3活性的改变，表明NSAIDs对bcl-2的抑制作用可以通过非COX-2途径发挥作用;进而Moalic-Juge等[11]研究显示NS-398(COX-2选择性抑制剂)可以通过抑制NF-κB活性及升高bax/bcl-2比值从而影响凋亡基因的表达;以上研究均提示NSAIDs可以通过多种途径发挥促肿瘤凋亡作用。有资料显示，某些NSAIDs可以通过与IKK的ATP结合位点结合而抑制IKK活性及调节RelA核转位等途径抑制NF-κB的激活[12-13]，并且可以通过抑制NF-κB与DNA结合能力[14]而降低相关基因转录。

　　本实验结果显示：舒林酸可以抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖，促使细胞凋亡，可能与下调NF-κB、bcl-2表达，上调bax表达有关。提示NF-κB途径在舒林酸促进胃癌SGC-7901细胞凋亡中发挥部分作用。但此实验仅为体外实验，在体内继续印证及使用NF-κB通路抑制剂进行研究将是下一步研究的方向。

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