添加丙氨酰谷氨酰胺胃肠外营养对烫伤大鼠的作用

　　【摘要】 目的 探讨添加丙氨酰谷氨酰胺(Ala-Gln)全胃肠外营养(TPN)对烫伤大鼠的空肠黏膜、蛋白质代谢及创面肉芽组织的影响。方法 33只SD大鼠，随机分为非烫伤正常参照组(正常组)、传统TPN组(传统组)和添加Ala-Gln的TPN组(二肽组)，每组各11只。正常组自由饮食，另2组大鼠在颈外静脉插管后行30%体表面积Ⅲ度烫伤，并接受等热量(780 kJ·kg-1·d-1)等氮量(1.8 g氮量·kg-1·d-1)TPN 7天，留取24 h尿测每日氮平衡和累积氮平衡;7天后取血测定总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、前白蛋白(PAB)、转铁蛋白(TRF)，高效液相法检测肌肉中谷氨酰胺(Gln)的含量;取一段空肠作黏膜形态学观察;光镜下观察烫伤创面肉芽组织的情况。结果 二肽组的血清PAB、TRF及肌肉中Gln含量明显高于传统组(P<0.01)，空肠黏膜绒毛高度、隐窝深度、黏膜厚度、绒毛表面积明显高于传统组(P<0.01)，创面肉芽组织中的毛细血管和成纤维细胞密度明显高于传统组(P<0.01)。结论 烫伤大鼠应用添加Ala-Gln的胃肠外营养能改善机体氮平衡，促进机体蛋白质合成，减少肌肉中Gln含量的下降，减轻空肠黏膜的萎缩，促进烫伤创面的肉芽增殖愈合。

　　【关键词】 丙氨酰谷氨酰胺;胃肠外营养，全;小肠黏膜;代谢;肉芽组织;烧伤;大鼠

　　Effect of alanyl-glutamine-supplemented total parenteral nutrition on intestinal mucosa, protein metabolism and granulation tissues of the burn wounds in scalded rats

　　SANG Jianfeng，WU Wenxi，XU Qin，HUA Yibing，DING Qiang，ZHOU Shougui

　　1. Department of Genenral Surgery, Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing,

　　Jiangsu 210008, China; 2. Department of Gastrointestinal Surgery, The First Affiliated Hospital of Nanjing

　　Medical University, Nanjing, Jiangsu 210029; 3. Department of Burn Surgery, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University

　　Abstract： Objective To evaluate the effect of alanyl-glutamine (Ala-Gln)-supplemented total parenteral nutrition (TPN) on the intestinal mucosa, protein metabolism and granulation tissues of the wounds in scalded rats. Methods 33 SD rats were randomly divided into three groups (n=11): control group, conventional TPN group (convention group) and Ala-Gln supplemented TPN group (Ala-Gln group). The control group received standard diet, while the two TPN groups having been placed a central venous catheter and subjected to 30% TBSA III0 burn received isocaloric (780kJ·kg-1·d-1) and isonitrogenous (1.8gN·kg-1·d-1, 48% of nitrogen was supplied with Ala-Gln in Ala-Gln group) TPN for 7 days. Nitrogen balance (NB) and cumulated nitrogen balance (CNB) were monitored. At the end of TPN, serum total protein (TP), albumin (ALB), prealbumin (PAB), transferrin (TRF), Gln in muscle were monitored. Jejunal mucosal morphological changes were observed with light microscopy. The density of capillary vessels and fibroblasts in granulation tissues on wound was observed with light microscopy. Results Serum PAB, TRF, Gln level in muscle and CNB in Ala-Gln group were significantly higher than those in the convention group (P< 0.01). The jejunal villus height, crypt depth, mucosal thickness and villous surface area significantly increased in Ala-Gln group. The density of capillary vessels and fibroblasts in the granulation tissues in Ala-Gln group was significantly higher than that in the convention group (P< 0.01). Conclusion Ala-Gln supplemented TPN in scalded rats could promote protein anabolism, improve nitrogen balance, attenuate the decline in Gln in the muscles and attenuate intestinal mucosal atrophy, improve T lymphocyte immune function and promote granulation proliferation and wound healing.

　　Key words: alanyl-glutamine; parenteral nutrition, total; intestinal mucosa; metabolism; granulation; burns; rats

　　谷氨酰胺( Glutamine, Gln) 是一种体内含量丰富的游离氨基酸, 它是所有快速增殖细胞的能源物质，如小肠黏膜上皮细胞、淋巴细胞、肿瘤细胞等, 也被认为是应激状态下的“条件必需氨基酸”。烫伤应激状态下，体内蛋白质(尤其是骨骼肌蛋白质)分解和尿氮排泄增加，Gln消耗增加，血浆及组织中Gln浓度下降。补充Gln有可能改善机体氮平衡、促进机体蛋白质合成、减轻小肠黏膜的萎缩。但Gln水溶解度低，且不稳定，在加热灭菌时生成有毒的焦谷氨酸和氨，限制了Gln在肠外营养中的使用，而丙氨酰谷氨酰胺(Ala-Gln)克服了以上缺点，进入体内很快生成Gln。本实验观察了添加Ala-Gln的全胃肠外营养(TPN)对烫伤大鼠的蛋白质代谢、空肠黏膜及烫伤创面的肉芽组织的作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物分组

　　33只雄性SD大鼠(南京医科大学实验中心提供)，体重200～250 g，随机分为非烫伤正常参照组(正常组)、传统TPN组(传统组)和添加Ala-Gln的TPN组(二肽组)，每组11只。

　　1.2 中心静脉置管

　　禁食24 h后，传统组和二肽组大鼠称重，2%氯氨酮(100 mg/kg)腹腔内注射麻醉后，以8%～10%硫化钠水溶液脱去颈部、背部体毛，温水擦净，碘伏消毒皮肤，右颈部作纵形切口，显露右侧颈外静脉，远端结扎，近端插入外径1.2 mm、内径0.6 mm的硅胶管至上腔静脉(插入1.0～2.0 cm)。硅胶管自皮下隧道从背部肩胛间皮下引出后接保护弹簧及自制旋转装置。正常组不置管。

　　1.3 烫伤模型制作和饲养

　　根据公式S=0.091×W2/3〔S为体表面积(m2)、W为大鼠体重(kg)〕计算出大鼠体表面积，在大鼠仍处于麻醉状态下，将传统组和二肽组大鼠已行脱毛处理的背部浸入100℃水中12 s，造成30%体表面积的Ⅲ度烫伤。伤后立即按体重腹腔内注射林格液(2.5 ml·100 g-1)，置入代谢笼，自中心静脉置管用微量注射泵持续注林格液(11.25 ml·100 g-1)抗休克治疗。正常组不做烫伤处理，置入笼中自由饮食。饲养室内温度保持在25℃左右，每天保持约12 h光照，紫外线消毒室内空气每天1次，乙醇擦洗代谢笼以保持代谢笼清洁;每天碘伏消毒烫伤创面和手术切口。

　　1.4 营养支持

　　传统组和二肽组大鼠接受等热量等氮量TPN：热量780 kJ·kg-1体重，采用葡萄糖和脂肪乳剂(30%英特利匹特，华瑞公司生产)双能源3∶2比例提供。每千克体重氮量1.8 g：传统组氮源由8.5%乐凡命(华瑞公司生产)供给，二肽组氮源由8.5%乐凡命中添加Ala-Gln(费森尤斯公司生产的20%力肽，其中力肽提供的氮量占总氮量的48%)。非蛋白热量：氮量=434 kJ∶1 g。2组TPN液中均加入适量的水溶性、脂溶性维生素、微量元素、电解质以及胰岛素(按每10 g葡萄糖1 U给予)。TPN液配方见表1。自中心静脉插管用微量注射泵均匀持续输注TPN液，烫伤当日每天每100 g体重给予11.25 ml，第2～7天每天每100 g体重给予22.5 ml。表1 传统组和二肽组TPN营养液配方(略)

　　1.5 标本收集与检测

　　第8天晨处死动物，取标本检测各观察指标。

　　1.5.1 体重变化

　　第8天大鼠称重，观察TPN前后的体重变化情况。

　　1.5.2 血生化检查

　　腹主动脉穿刺取血，置入干燥管中，血凝后离心20 min (1500 r·min-1)，取上清-20℃冷冻保存，采用全自动生化分析仪检测血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(G)，采用免疫浊度法检测前白蛋白(PAB)、转铁蛋白(TRF)。

　　1.5.3 肌肉组织中Gln含量的测定

　　取大腿肌肉一块，立即液氮冷冻，移入-80℃深低温水箱保存，集中用高效液相色谱法测定肌肉中Gln的含量[1]。

　　1.5.4 氮平衡和累积氮平衡测定

　　收集大鼠24 h尿液，微量凯氏定氮法检测24 h尿液中氮量。氮平衡(g·kg-1)=〔入氮(g)-出氮(g)〕/体重(kg)。TPN时，入氮即营养液中氨基酸的含氮量，出氮主要为24 h尿液中的氮量。第n天的累积氮平衡=第1～n天的氮平衡的累加。

　　1.5.5 空肠黏膜形态学观察

　　距Treitz韧带8 cm处取一段空肠，10%甲醛溶液固定，常规病理切片，于光镜下用多媒体彩色病理图文分析系统测量绒毛高度(VH)、绒毛宽度(VW)、隐窝深度及黏膜厚度，根据公式VSA=л×VW×VH计算出绒毛表面积(VSA)，每张切片随机测量5个绒毛，取平均值。

　　1.5.6 创面肉芽组织的观察

　　取背部烫伤皮肤一块，10%甲醛固定，常规石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色、树脂封片，光镜下观察肉芽组织中毛细血管和成纤维细胞的密度，每张切片高倍镜观察至少8个不同的视野，对毛细血管和成纤维细胞进行计数，取平均值。

　　1.6 统计学处理

　　全部数据采用±s表示，应用SPSS 10.0软件包进行数据处理，采用t检验进行差异比较。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 TPN前后体重的变化

　　2组大鼠TPN后体重均下降，传统组尤为明显(t=5.65,P<0.01),二肽组也有下降(t=3.13,P<0.05)，TPN前后以及体重差两组间差异无显著意义(表2)。表2 传统组和二肽组体重变化(略)

　　2.2 血清蛋白质浓度

　　传统组和二肽组血清TP、ALB均比正常组明显降低，二肽组PAB、TRF比正常组和传统明显升高。见表3。表3 3组大鼠血清蛋白质浓度(略)

　　2.3 肌肉Gln含量

　　经方差分析3组的肌肉Gln含量差别有统计学意义(F=16.63，P<0.01)。进一步进行两两比较发现：传统组明显低于正常组(q=7.64，P<0.01);二肽组也低于正常组(q=3.46，P<0.05),但显明高于传统组(q=4.18，P<0.05)。见表4。表4 3组大鼠肌肉中Gln含量(略)

　　2.4 每日氮平衡和累积氮平衡

　　二肽组每日氮平衡均高于传统组，其中第2、4、5天每日氮平衡2组间差异有统计学意义，其他时点组间差异无统计学意义(P>0.05，表5)。二肽组的累积氮平衡均高于传统组，其中第1天组间差异无统计学意义(P>0.05)，其余时点2组间差异均有统计学意义(P<0.05，表6)。表5 传统组和二肽组每日氮平衡(略)表6 传统组和二肽组累积氮平衡(略)

　　2.5 小肠形态学改变

　　传统组及二肽组中小肠黏膜绒毛高度、隐窝深度、黏膜厚度及绒毛表面积均明显低于正常组，传统组中各数据均明显低于二肽组，各组间差异均有统计学意义(P<0.01)。具体数据见表7。表7 小肠形态学改变(略)

　　2.6 烫伤创面肉芽组织病理学检查

　　二肽组肉芽组织中毛细血管和成纤维细胞的密度明显高于传统组(P<0.01)。见表8。表8 烫伤创面肉芽组织中毛细血管和成纤维细胞密度(略)

　　3 讨 论

　　烫伤后机体处于应激状态下，神经内分泌功能紊乱，儿茶酚胺大量释放，胰高血糖素及皮质类固醇分泌增加，甲状腺素分泌减少;某些细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL-1、IL-6)等生成增加;另外，一氧化氮、氧自由基、前列腺素等也在应激代谢中起了一定作用。在这些因素的共同参与下，机体呈分解代谢状态，蛋白质分解相对增加，合成相对减少，尿氮排出增加。

　　机体骨骼肌几乎含有体内一半的游离氨基酸，其中Gln占60%以上，因而Gln 是机体内含量最丰富的游离氨基酸。烫伤应激时机体骨骼肌迅速分解并释放Gln入血，供其他器管如肠、肝、肾等使用，而应激时这些脏器Gln的消耗增加[2]。这必然导致血浆和组织，尤其骨骼肌中的Gln含量下降，因而本实验中传统组与二肽组大鼠骨骼肌Gln含量明显低于正常组。本实验结果中二肽组大鼠肌肉Gln含量明显高于传统组，表明添加二肽有效地增加了肌肉中Gln的含量。有人研究证明肌肉中Gln含量与肌肉蛋白合成呈正比，与蛋白分解呈反比。因而肌肉中Gln含量的相对增加，有效地防止肌肉的萎缩。

　　血清ALB影响因素较多，且半衰期长约20天，对营养状况和蛋白质代谢的短期变化不敏感;TRF半衰期较短约为8天，是评价蛋白质营养状况比较敏感的指标;而PAB半衰期更短为12 h，能较快地反映机体蛋白质营养状况。本实验结果中传统组和二肽组大鼠血清ALB明显低于正常组，这与某些细胞因子如IL-6的增加导致肝细胞内ALB mRNA浓度下降有关;二肽组PAB、TRF明显高于传统组和正常组，说明添加二肽TPN促进蛋白合成。值得一提的是：本实验中，除第1天部分大鼠呈负氮平衡，其余时点2组均呈正氮平衡，这可能与烫伤创面坏死组织及创面下渗出液无法收集，不能计算这两者所损失的氮有关。另外，TPN液中给予的氮量较多也是原因之一。与传统组相比，二肽组第2、4、5日氮平衡和第2～7日累积氮平衡明显改善，且差异有统计学意义。本结果表明添加二肽的TPN明显改善了机体氮平衡和促进蛋白质的合成。

　　长期TPN可导致肠黏膜萎缩、肠黏膜渗透性增加、肠道免疫功能障碍和肠道细菌移位。本实验中传统组和二肽组小肠黏膜绒毛高度、黏膜厚度、隐窝深度和绒毛表面积明显低于正常组，反映了TPN后肠黏膜萎缩的不良反应。但二肽组的以上指标又明显好于传统组，这说明Ala- Gln能减轻小肠黏膜萎缩，其机制：①Ala-Gln提供了小肠吸收利用的Gln，提供了氧化利用的能源和用于合成嘧啶、嘌呤等的氮源，有助于小肠上皮细胞分裂复制;②Gln能促进某些激素的释放，如蛙皮素、神经降压素、肠高血糖素。高血糖素能提高小肠谷氨酰胺酶的活性，从而促进Gln的消耗利用。Gln还能刺激胰腺和胆汁分泌，它们在小肠上皮细胞生长中起到重要作用;③Gln能防止肠上皮细胞凋亡[3-6]。

　　烫伤创面包括炎症反应，细胞增殖、分化、移行，血管神经再生，细胞外基质的合成与重建，以及后期的收缩与瘢痕形成等一系列过程。烫伤24 h内，成纤维细胞及毛细血管内皮细胞即开始增殖，以后逐渐形成肉芽组织。成纤维细胞在创面愈合过程中担任主要角色，通过细胞迁移、分化、分裂、增殖，分泌胶原、蛋白糖苷、纤维粘连蛋白等细胞外基质成分的途径参与创面愈合。本实验中，二肽组烫伤创面肉芽组织中毛细血管和成纤维细胞的密度明显高于传统组。这与血管内皮细胞和成纤维细胞中含有较高活性的谷氨酰胺酶，能较好地利用Gln有关：补充Gln给这些快速增殖细胞提供了充足的能源，使之在肉芽组织形成中更好地发挥其生理功能，促进烫伤创面的愈合。

　　综上所述，烫伤大鼠应用添加Ala-Gln的胃肠外营养能改善机体氮平衡，促进机体蛋白质合成，减少肌肉中Gln含量的下降，减轻空肠黏膜的萎缩，促进烫伤创面的愈合。

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