重组血红素加氧酶-1乳酸乳球菌灌胃后大鼠肠道中血红素加氧酶-1重组蛋白含量变化

　　【摘要】 目的 观察重组血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)乳酸乳球菌灌胃后大鼠肠道中重组HO-1蛋白的含量。方法 制备HO-1乳酸乳球菌悬液和乳酸乳球菌悬液,不同剂量和不同次数灌胃SD大鼠，在规定时间取回肠组织，酶联免疫吸附法和免疫组化法分析回肠组织HO-1的含量和分布情况。结果 重组HO-1蛋白吸收后进入肠上皮细胞的胞膜和胞质中。回肠组织中HO-1含量：5倍、10倍HO-1乳酸乳球菌灌胃比20倍HO-1乳酸乳球菌灌胃高(P<0.01),连续灌胃4天、7天比连续灌胃10天含量高(P<0.01)。结论 乳酸乳球菌中重组HO-1蛋白可以被回肠吸收，但在一定程度后增加HO-1乳酸乳球菌灌胃剂量和次数不能有效增加回肠中重组HO-1蛋白的含量。

　　【关键词】 乳酸乳球菌;血红素加氧酶-1;回肠

　　A study of the variations in intestinal content of recombinant heme oxygenase-1

　　following gastrogavage with the heme oxygenase-1-secreting Lactococcus lactis strain

　　PANG Qingfeng1, ZHOU Qiang2, ZHOU Qiaomei2, ZENG Yinming2

　　(1. Department of Pathophysiology, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China;

　　2. Anesthesiology Institute of Jiangsu Province, Xuzhou, Jiangsu 221002, China )

　　Abstract: Objective To investigate the variations in the intestinal content of recombinant heme oxygenase-1 (HO-1) following gastrogavage of the HO-1-secreting Lactococcus lactis strain. Methods The HO-1-secreting Lactococcus lactis strain and Lactococcus lactis suspension were prepared by culture and centrifugation. The healthy SD rats underwent gavage of Lactococcus lactis strain at different doses and different time points. Immunohistochemistry and ELISA method were employed to determine the distribution and HO-1 content in ileal tissue. Results The absorbed recombinant HO-1 was mainly located in the cytoplasm and cytomembrane of ileal tissue. The HO-1 content in the ileal tissue in low (5 and 10 times) dose groups was higher than that in high (20 times) dose groups (P<0.01); the HO-1 content in ileal tissue in short gavage duration groups was higher than that in long (10 days) gavage duration groups (P<0.01). Conclusion While HO-1 can be absorbed by the ileum, the increase in gavage doses and times of the HO-1-secreting Lactococcus lactis cannot effectively increase the content of HO-1 in the ileum.

　　Key words: Lactococcus lactis; heme oxygenase-1; ileum

　　血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是血红素分解代谢的限速酶，可催化血红素在机体内氧化分解，生成胆绿素、CO和Fe2+。最初人们认为 HO-1的作用仅限于催化血红素氧化降解，维持体内血红素的平衡。近年的研究发现，HO-1在抗氧化应激损伤[1 -2]、调节微循环[3- 4]等方面具有重要的作用。本课题组前期研究发现：①灌胃后重组血红素加氧酶-1乳酸工程菌(LL-HO-1)能到达大鼠回肠组织中，在回肠组织中原位分泌大量重组HO-1;②原位分泌的重组HO-1能发挥抗炎效果，对失血性休克和内毒素血症所致的大鼠回肠组织损伤仅有部分的保护作用，不能使损伤的肠组织得到完全修复，其原因可能与原位分泌的重组HO-1较少有关[5-6]。为了提高重组HO-1对大鼠回肠组织的保护效果，本研究拟通过观察LL-HO-1不同灌胃剂量和次数对回肠组织中重组HO-1的影响，探索重组HO-1在回肠中的含量变化规律，为LL-HO-1治疗肠道疾病奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 大鼠灌胃菌液制备 含重组质粒 pSEC-HO-1(本研究室构建) 的乳酸乳球菌 NZ9000(LL-HO-1，本研究室构建) 在脑心浸液培养基中 30℃培养至D600=0.5～0.6时，加入诱导物 Nisin (Sigma 公司)至终浓度 10 mg/L，继续培养3 h。终止培养后，菌落计数达5×109 CFU/ml，4℃离心(8 000 r/min×5 min)、PBS重悬后分别制备成5倍、10倍、20倍浓缩的1ml菌液。在同样条件下培养未转染的乳酸乳球菌 NZ9000(LL，野生型), 收集菌落做对照。

　　1.2 试验动物及分组

　　1.2.1 试验动物 SD大鼠，体重250～300 g，徐州医学院实验动物中心提供。

　　1.2.2 灌胃量对回肠组织中HO-1含量影响 SD大鼠72只，分为4组，每组18只：①5倍LL-HO-1组，② 10倍LL-HO-1组，③ 20倍LL-HO-1组，④ LL组。LL组予1 ml (5×109 CFU/ml) 活野生型乳酸乳球菌悬液灌胃，LL-HO-1各组相应时间点给予等体积不同浓度的重组乳酸乳球菌悬液1 ml灌胃，每天灌胃1次。各组大鼠于灌胃后第1、2、4天后用5%戊巴比妥钠(0.2 ml/100 g) 腹腔麻醉，处死动物取材。

　　1.2.3 灌胃次数对回肠组织中HO-1含量影响 鉴于试验1.2.2中我们观察到浓缩10倍的LL-HO-1组回肠组织中HO-1的含量最多，因此本部分试验采浓缩10倍的LL-HO-1灌胃。SD大鼠36只，分为LL-HO-1组和LL组，每组18只。灌胃方法同上。各组大鼠在灌胃后第4、7、10天后用5%戊巴比妥钠(0.2 ml/100 g) 腹腔麻醉，处死动物取材。

　　1.3 检测指标

　　1.3.1 组织学检查 取回肠组织固定， 常规脱水， 包蜡, 切片， 行苏木精-伊红染色， 光镜下观察肠组织的变化。

　　1.3.2 免疫组化法(ELISA)分析肠组织中重组HO-1的分布情况 免疫组化采用链酶亲和素-过氧化物酶法，染色程序按SABC法操作常规进行。HO-1一抗为美国Chemicon 公司产品，HO-1二抗试剂盒购自武汉博士德公司。

　　1.3.3 酶联免疫吸附法测定肠组织HO-1含量 取回肠组织用锡纸包裹，置于液氮中速冻。采用酶联免疫吸附试剂盒(Chemicon公司，美国)测定 HO-1含量。具体操作按照说明书进行。

　　1.4 统计学处理 采用 SPSS 12.0统计软件包进行数据处理，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析(ANOVA)和最小显著差法(LSD)进行差异分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 组织学检查 各组肠组织的形态学无明显改变，提示LL-HO-1对肠道无损害作用。

　　2.2 回肠组织HO-1的分布情况 重组HO-1蛋白主要分布于回肠上皮组织细胞的胞质和胞膜中;而LL组回肠上皮组织细胞中没有重组HO-1蛋白阳性细胞。见图1。

　　2.3 回肠组织中HO-1含量变化

　　2.3.1 灌胃量对HO-1含量影响 灌胃1天后HO-1含量无明显差异，而灌胃2、4天后5倍、10倍组比20倍组、LL组含量高(P<0.01)，其中10倍组最高。见表1。表1 不同剂量灌胃后回肠中HO-1的含量与20倍LL-HO-1组和LL组比较：*P<0.01

　　2.3.2 灌胃次数对HO-1含量影响 10倍HO-1组各时间点HO-1含量较LL组均增高(P<0.01);在LL-HO-1组中，连续灌胃第4天时HO-1最高，随着灌胃次数增加，HO-1含量逐渐减少。见表2。表2 不同次数灌胃后回肠组织中HO-1的含量与 同组10天比较：*P<0.01; 与LL组比较：#P<0.01

　　3 讨 论

　　研究发现利用腺病毒载体介导HO-1后，可以有效减轻心脏[7]、肺组织[8]等重要器官的损伤。由于肠道解剖结构的复杂性，目前常用的病毒载体无法特异性地对肠道进行基因治疗。乳酸乳球菌基因表达系统的建立为肠道基因治疗提供了新的契机。

　　乳酸乳球菌(Lactococcus lactis，LL) 是一类长期应用于食品发酵业的有益微生物,这种食品级微生物能在肠道内存活2～3 天，其本身不攻击肠黏膜并且不引起强的免疫反应。当带有NisA 启动子及PAL 基因的质粒pSEC:HO-1 导入不能产Nisin但含有NisR 和NisK 蛋白的乳酸菌菌株NZ9000后，HO-1基因以很低的水平表达。这种表达水平检测不到。当细菌达到对数生长期时,向培养基中加入Nisin 后，位于NisA 启动子下游的HO-1基因被激活转录,持续表达一定数量的蛋白。被Nisin诱导激活的LL-HO-1灌注进入肠道中后，LL-HO-1可以紧密黏附在肠上皮细胞上，原位分泌HO-1，使肠道中HO-1含量增加。

　　与化学药品不同，乳酸工程菌进入体内后，其灌胃的菌液量与重组蛋白分泌量之间的关系非常复杂。大量的乳酸菌可以被胃酸及其消化酶破坏，只有一部分乳酸菌能进入肠道中。肠道中的环境非常复杂，其中许多的消化酶和细菌均可以对进入肠道中的LL-HO-1功能产生影响[9]。

　　一般情况下，通过增加给药剂量和次数可以有效增加组织和器官中的有效药物浓度，从而达到理想治疗效果。但本实验中发现，在一定程度上单纯增加LL-HO-1灌胃剂量和次数不能有效增加回肠中HO-1的含量，反而可能使回肠中HO-1的含量降低。我们推测其可能的原因是：①当菌液高度浓缩时会导致菌液紧密粘连，不容易分散为单个菌株。灌胃后进入肠道中可能仍然已菌块的形式存在;无法有效分泌HO-1。因此，依靠增加LL-HO-1灌胃剂量可能不能有效增加回肠中HO-1的含量。②在正常情况下，HO-1在肠组织中不表达，只有当肠道受各种有害刺激因子的损伤如缺血、炎症等情况下大量表达，发挥重要的抗炎、抗氧化等保护作用。而本实验使用的是正常大鼠，HO-1含量增加后可能会激活HO-1内源性清除机制，使回肠中HO-1的含量降低。以上原因分析有待进一步证实。

　　从本研究结果看，如果要提高乳酸工程菌体内分泌重组蛋白的含量，需要从改善乳酸工程菌的性状及其改变胃肠道微环境等方面进行研究，才能使乳酸工程菌的基因治疗达到一个理想的效果。

　　【参考文献】

　　[1] Giannini L, Vannacci A, Fabrizi F, et al. Protection from cardiac injury by induction of heme oxygenase-1 and nitric oxide synthase in a focal ischaemia-reperfusion model [J]. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand), 2005, 51(4): 393-401.

　　[2] Nagy E, Jeney V, Yachie A, et al. Oxidation of hemoglobin by lipid hydroperoxide associated with low-density lipoprotein (LDL) and increased cytotoxic effect by LDL oxidation in heme oxygenase-1 (HO-1) deficiency [J]. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 2005, 51(4): 377-385.

　　[3] Achouh P, Simonet S, Badier-Commander C, et al. The induction of heme oxygenase 1 decreases contractility in human internal thoracic artery and radial artery grafts [J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2005, 130(6): 1573 -1580.

　　[4] Sakamoto N, Kokura S, Okuda T, et al. Heme oxygenase-1 (Hsp32) is involved in the protection of small intestine by whole body mild hyperthermia from ischemia/reperfusion injury in rat [J]. Int J Hyperthermia, 2005, 21(7): 603 -614.

　　[5] Pang QF, Ji Y, Bermúdez-Humarán LG, et al. Protective effects of a heme oxygenase-1-secreting Lactococcus lactis on mucosal injury induced by hemorrhagic shock in rats [J]. J Surg Res, 2009,153(1):39-45.

　　[6] Pang QF, Ji Y, Li Y, et al. Intragastric administration with recombinant Lactococcus lactis producing heme oxygenase-1 prevents lipopolysaccharide-induced endotoxemia in rats [J]. FEMS Microbiol Lett, 2008, 283(1): 62-68.

　　[7] Liu X, Simpson JA, Brunt KR, et al. Preemptive heme oxygenase-1 gene delivery reveals reduced mortality and preservation of left ventricular function 1 yr after acute myocardial infarction [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2007, 293(1): H48-H59.

　　[8] Shinohara T, Kaneko T, Nagashima Y, et al. Adenovirus-mediated transfer and overexpression of heme oxygenase 1 cDNA in lungs attenuates elastase-induced pulmonary emphysema in mice [J]. Hum Gene Ther, 2005, 16(3): 318 - 327.