塞来昔布对高表达Her-2/neu的人乳腺癌SKBr3细胞增殖及凋亡的影响

　　【摘要】 目的 探讨环氧合酶-2(COX-2)抑制剂塞来昔布对人乳腺癌细胞SKBr3的抑制增殖及诱导凋亡作用。方法 4种不同浓度的塞来昔布处理乳腺癌细胞系SKBr3细胞24、48 h，MTT法测定24、48 h后SKBr3细胞的增殖活性，流式细胞仪(FCM)检测48 h后各浓度塞来昔布诱导细胞凋亡情况及对细胞周期的影响。结果 与对照组相比，塞来昔布以时间、剂量依赖性方式抑制SKBr3细胞增殖(P<0.05)。作用48 h后，塞来昔布诱导SKBr3细胞凋亡并阻断了细胞周期进展，凋亡率随塞来昔布浓度的增加而增加(P<0.05)，且随着药物浓度的增加，G0/G1期细胞比例逐渐增加、S期及G2/M期细胞比例逐渐下降(P﹤0.05)。结论 塞来昔布抑制高表达Her-2/neu的SKBr3细胞的增殖，诱导其凋亡。

　　【关键词】 塞来昔布;乳腺癌;SKBr3细胞;增殖;凋亡

　　Effect of celecoxib on the proliferation and apoptosis of human

　　Her-2/neu-overexpressing breast cancer cell line SKBr3

　　LIU Xiaohui1， LIU Taifeng1， WANG Yue2

　　(1.Department of Oncology, The First People′s Hospital of Xuzhou, Xuzhou, Jiangsu 221002, China;

　　2.Department of Breast Cancer, 307 Hospital of Chinese People′s Liberation Army, Beijing 100071, China)

　　Abstract: Objective To investigate the antitumor effects of celecoxib-a cyclooxysenase-2 (COX-2) inhibitor on inhibiting proliferation and inducing apoptosis of Her2/neu-overexpressing human breast cancer cell line SKBr3. Methods Human breast cancer cell line SKBr3 cells were treated with celecoxib for 24 h and 48 h at 4 different concentrations, respectively. The proliferative activity was determined at the two time points by MTT assay and the effect of 4 concentrations of celecoxib on apoptosis induction and cell cycle of SKBr3 cells were detected by flow cytometry. Results Compared with the control group, celecoxib significantly inhibited the proliferation of SKBr3 cells in a dose-and time-dependent manner (P<0.05). 48 h after treatment, celecoxib induced the apoptosis of the cells and blocked the progress of SKBr3 cell cycle; with the rise of celecoxib concentration, the apoptotic rate increased (P<0.05), the SKBr3 cell proportion in G0/G1 cycle also gradually increased, while SKBr3 cell proportion in cycles S and G2/M gradually decreased (P<0.05). Conclusion Celecoxib can inhibit the proliferation of SKBr3 cells overexpressing Her-2/neu and induce the cell apoptosis.

　　Key words： celecoxib; breast cancer; SKBr3 cell; proliferation; apoptosis

　　乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，目前我国乳腺癌发病率呈明显上升趋势。20%～30%的乳腺癌患者Her-2/neu原癌基因高表达，阳性表达Her-2/neu者恶性程度高，病情进展迅速，预后不良[1]。因此，针对Her-2/neu靶向治疗的研究是近几年持续研究的热点。塞来昔布(celecoxib,西乐葆)是第一个用于临床的环氧合酶-2(COX-2)选择性抑制剂，在肿瘤治疗中的作用受到愈加广泛的关注。研究发现塞来昔布可抑制多种肿瘤细胞增殖，诱导其分化成熟及凋亡，且对正常细胞无明显毒副作用[2]。本实验研究塞来昔布对高表达Her-2/neu的乳腺癌细胞株SKBr3细胞增殖及凋亡的影响，并进一步分析其可能的作用机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要药物和试剂 塞来昔布购自合肥森瑞股份有限公司;胎牛血清(FBS)购自天津市血液病研究所;RPMI 1640、胰蛋白酶、四氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、磷酸盐缓冲液(PBS)均由浙江大学生物工程系龚莹岚博士惠赠。

　　1.2 细胞培养 SKBr3人乳腺癌细胞株购自协和医科大学基础医学院细胞中心。实验前复苏，置于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中，在37℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱内培养。0.25%胰酶消化，3～4天传代1次。

　　1.3 实验分组 塞来昔布溶解于DMSO，用RPMI 1640培养液稀释到所需浓度，并确保DMSO浓度﹤0.1%。取对数生长期细胞，分别加入终浓度为15、30、60、120 μmol/L的塞来昔布，继续培养24、48 h，根据不同实验要求收集细胞。设立对照组，即培养液中仅加细胞，不加药物。

　　1.4 实验方法

　　1.4.1 细胞形态观察 在培养皿中放入载玻片培养细胞，加入药物后继续培养24 h，取出载玻片在倒置显微镜下观察细胞形态学变化并摄片。

　　1.4.2 MTT法检测细胞增殖抑制情况 对数生长期的SKBr3细胞以1×105/ml的密度接种于96孔培养板，每孔200 μl。贴壁24 h后换液，设4个实验组，加入塞来昔布使其终浓度分别为15、30、60、120 μmol/L，每一浓度、每个时间点均设3个复孔，继续培养24、48 h。对照组细胞不加塞来昔布。实验终止前4 h各孔加入MTT(5 mg/L)20 μl，继续培养4 h后弃上清，每孔加入DMSO 150 μl，震荡10 min待结晶溶解后，在酶标仪570 nm波长处测定各孔光密度(D)值，按下列公式计算细胞增殖抑制率：抑制率(%)=(1-实验组D平均值/对照组D平均值)×100%。

　　1.4.3 流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率及周期分布 收集对照组及不同浓度塞来昔布(30、60、120 μmol/L)处理48 h后的SKBr3细胞，用4℃预冷的70%乙醇固定12 h，离心后弃固定液，PBS重悬5 min后400目筛网过滤，加入PI染色液，4℃避光染色30 min，上FCM测试凋亡率及分析细胞周期。激发波长为488 nm。

　　1.5 统计学处理 用SPSS 11.5统计软件进行数据处理，数据以±s表示。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 形态学观察 对照组：细胞扁平，生长旺盛，呈梭形、多角形贴壁生长，形态饱满，境界清晰，核膜、核仁轮廓明显，细胞间结构紧密。塞来昔布60 μmol/L处理细胞24 h后细胞呈现凋亡的形态学变化：可见大量细胞变圆，体积变小，结构变松散，部分细胞表面发芽，细胞形状不规则，部分脱落漂浮，少数细胞体积增大、破裂，呈坏死状;胞浆致密，染色质固缩、集聚至周边呈月牙形斑块;细胞周围碎片增多(图1、2)。

　　图1 对照组细胞形态 (×200)

　　图2 塞来昔布 60 μmol/L处理24 h细胞形态 (×200)

　　2.2 塞来昔布对SKBr3细胞生长的抑制作用 不同浓度塞来昔布作用于SKBr3细胞24、48 h后，MTT法测定结果显示：塞来昔布显著抑制SKBr3细胞的增殖，且呈时间、剂量依赖性(P﹤0.05)，即随着塞来昔布作用时间和作用浓度的增加而抑制作用增强(表1)。表1 塞来昔布对SKBr3细胞的抑制率比较：P﹤0.05;24 h和48 h组间比较及组内各浓度间比较：P﹤0.05

　　2.3 塞来昔布对SKBr3细胞凋亡的影响 FCM检测结果显示：SKBr3细胞经各浓度组塞来昔布作用48 h后均出现明显的亚G1期AP峰，即“凋亡峰”，对照组未出现明显凋亡峰。凋亡率随塞来昔布浓度的增加而增加，呈量效关系(P﹤0.05)，见表2。

　　2.4 塞来昔布对SKBr3细胞周期分布的影响 SKBr3细胞经不同浓度塞来昔布作用48 h后，随着药物浓度的增加，G0/G1期细胞比例逐渐增加，S期及G2/M期细胞比例逐渐减少(P﹤0.05)。与对照组比较，G0/G1期、S期、G2/M期细胞比例发生明显变化，呈一定剂量依赖关系。见表2。表2 不同浓度塞来昔布对SKBr3细胞凋亡率及细胞周期的影响

　　3 讨 论

　　COX-2在多种恶性肿瘤中过表达，并参与肿瘤发生发展的过程。作为肿瘤预防与治疗的靶点，高效COX-2选择性抑制剂的作用机制成为近年来的研究热点。美国FDA于1999年批准将选择性COX-2抑制剂塞来昔布用于家族性腺瘤息肉病的辅助治疗。众多学者的研究结果显示：塞来昔布可通过多条途径有效抑制肺癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌及结直肠癌等多种恶性肿瘤细胞的生长，诱导细胞凋亡，阻滞细胞周期[3-5]。近来临床研究发现应用COX-2抑制剂2年以上，可显著降低乳腺癌的发病风险，但具体作用机制尚不明了[6]，且塞来昔布对Her-2/neu阳性的乳腺癌患者的疗效及机制方面的研究甚少。

　　本研究发现：塞来昔布以时间、剂量依赖性方式显著抑制SKBr3细胞增殖，120 μmol/L的塞来昔布持续作用48 h时，其抑制率可达74.5%;同时还诱导SKBr3细胞凋亡，凋亡率随塞来昔布浓度的增加而增加，120 μmol/L作用48 h，凋亡率为51.7%;塞来昔布阻断了细胞周期进展，且随着药物浓度的增加，G0/G1期细胞比例逐渐增加、S期及G2/M期细胞比例逐渐下降。我们据此推测：选择性COX-2抑制剂塞来昔布有可能通过某些途径来抑制Her-2/neu的表达，从而产生了上述实验结果。

　　国外研究发现：Her-2/neu过表达的人乳腺癌标本中COX-2水平升高，COX-2也可诱导Her-2/neu的表达，并与芳香化酶的产生有关[7]。COX-2与Her-2/neu通道中可能存在复杂的因子网络与信号转导系统互相诱导、互相促进。在直肠癌HCA-7细胞及HCA-7肿瘤异种移植物系中，联合应用Herceptin及塞来昔布比单用任何一种药物更有效[8]也论证了这一点。结合本实验结果，我们推论低毒剂量的塞来昔布联合Herceptin用于治疗Her-2阳性的乳腺癌是可行的，本实验为此提供了间接理论依据，有必要做进一步的基础及临床研究。

　　【参考文献】

　　[1] 张军一，麦国丰，郑航，等.乳腺癌HER-2、EGFR表达与生存期的相关性[J].第一军医大学学报，2003，23(10)：1090-1092.

　　[2] Giercksky KE. COX-2 inhibition and prevention of cancer [J]. Best Pract Res Clin Gastroenterol，2001，5(5)：821-833.

　　[3] Harris RE, Beebe-Donk J, Alshafie GA. Reduced risk of human lung cancer by selective cyclooxygenase 2 (Cox-2) blockade: results of a case control study [J]. Int J Biol Sci，2007，3(5):328-334.

　　[4] Basu GD, Pathangey LB, Tinder T， et al. Mechanisms underlying the growth inhibitory effects of the cyclo-oxygenase-2 inhibitor celecoxib in human breast cancer cells [J]. Breast Cancer Res，2005，7(4):R422-R435.

　　[5] de Heer P， Sandel MH， Guertens G， et al. Celecoxib inhibits growth of tumors in a syngeneic rat liver metastases model for colorectal cancer [J]. Cancer Chemother Phamacol，2008，62(5):811-819.

　　[6] Harris RE, Beebe-Donk J, Alshafie GA. Reduction in the risk of human breast cancer by selective cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitors [J]. BMC Cancer，2006，(6):27.

　　[7] Subbaramaiah K, Howe LR, Port ER， et al. HER-2/neu status is a determinant of mammary aromatase activity in vivo: evidence for a cyclooxygenase-2-dependent mechanism [J]. Cancer Res，2006，66(10):5504-5511.

　　[8] Mann M， Sheng H， Shao J， et al. Targeting cyclooxygenase-2 and HER-2/neu pathways inhibits colorectal carcinima growth [J]. Gastroenterology，2001，120(7):1713-1719.