裸鼠前列腺癌PC-3M细胞移植瘤模型的建立及其Her-2/neu蛋白免疫组化检测

　　【摘要】 目的 观察人前列腺癌细胞株PC-3M中Her-2/neu蛋白表达情况。建立人前列腺癌PC-3M细胞裸鼠移植瘤模型，观察肿瘤组织形态并检测肿瘤细胞中Her-2/neu蛋白的表达。方法 培养PC-3M细胞，制作细胞蜡块。将前列腺癌PC-3M细胞接种于裸鼠颈背部皮下，成瘤后切除肿块作石蜡切片苏木精-伊红染色观察肿瘤形态，肿块及PC-3M细胞蜡块均行免疫组化染色检测Her-2/neu蛋白的表达。结果 细胞蜡块免疫组化示PC-3M细胞表达Her-2/neu蛋白。裸鼠接种PC-3M细胞后成瘤率达100%，苏木精-伊红染色检查示分化差的恶性肿瘤形态，免疫组化染色示肿瘤细胞表达Her-2/neu蛋白。结论 人前列腺癌PC-3M细胞接种裸鼠成瘤率高，移植瘤模型保留了肿瘤的生物学特性及表达Her-2/neu蛋白免疫表型，为研究Her-2/neu蛋白在前列腺癌中的作用提供了较好的动物模型。

　　【关键词】 前列腺肿瘤;动物模型;裸鼠;Her-2/neu蛋白;免疫组织化学

　　Establishment of tumor xenograft model of PC-3M prostate cancer in nude mice

　　and detection of Her-2/neu by immunohistochemistry

　　ZHANG Yifen1, BAI Tao1, WU Hongyan1, DAI Yutian2, SUN Zeyu2*

　　(1.Department of Pathology, The Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing,

　　Jiangsu 210008, China; 2. Department of Urology, The Affiliated Drum Tower Hospital of

　　Nanjing University Medical School)

　　Abstract: Objective To investigate the expression of Her-2/neu protein in human prostate cancer cell line PC-3M, establish its animal model of tumor xenografts in nude mice, observe the histopathological features and detect the expression of Her-2/neu protein. Methods PC-3M cells were cultured to make cell blocks for immunohistochemical staining of Her-2/neu protein. Prostate cancer cell line PC-3M cells were subcutaneously implanted under the nape of nude mice. The paraffin slices of the removed tumor from xenografts were examined by hematoxylin-eosin staining for morphological features. The tumor slices and PC-3M cell blocks underwent immunohistochemical staining for the detection of Her-2/neu protein. Results PC-3M cells were immunopositive with Her-2/neu protein on the cell blocks. The tumor-formation rate was 100% in the nude mice after inoculation with PC-3M cells. Morphologically, the tumor cells showed the morphological features of poorly differentiated malignancy. Immunohistochemical staining revealed that the tumor cells were also immunopositive with Her-2/neu protein. Conclusion The tumor-formation rate is high by subcutaneous xenografts of PC-3M cells in nude mice. The tumor xenograft model retains the biological features of PC-3M cells and expresses Her-2/neu protein, which suggests that it might be a good animal model for the study of Her-2/neu protein in prostate cancer in vivo.

　　Key words: prostate neoplasms; animal model; nude mice; Her-2/neu protein; immunohistochemistry

　　随着我国人群中前列腺癌发病率的不断升高，研究者对前列腺癌防治的研究越来越重视。前列腺癌患者常因内分泌治疗过程中雄激素非依赖肿瘤细胞的出现及(或)发生骨转移等远处转移，无有效的治疗方法而死亡。基因治疗是近年来研究较多的治疗方法，利用前列腺癌动物模型是研究前列腺癌生物学行为以及进行前列腺癌治疗实验的重要方法之一。在对前列腺癌的研究中发现,Her-2/neu蛋白过表达可通过交叉激活(transactivation)雄激素受体(AR)、不依赖雄激素的存在而激活AR的转录[1]，引起肿瘤的发生及发展，提示Her-2/neu可能与激素非依赖前列腺癌的转变及患者生存期缩短有关，因此可作为前列腺癌基因治疗的靶点。本研究用不同浓度的PC-3M细胞在裸鼠体内建立皮下荷瘤模型，观察肿瘤成瘤及生长情况，选择合适的接种细胞浓度，检测PC-3M细胞及肿瘤组织中Her-2/neu蛋白的表达，观察肿瘤细胞形态及其Her-2/neu蛋白的表达情况，以期为研究Her-2/neu在前列腺癌中的作用及针对Her-2/neu的肿瘤治疗的研究提供良好的动物模型。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 细胞 人前列腺癌PC-3M细胞株购自南京凯基生物科技发展有限公司。在5% CO2 37℃条件下用RPMI-1640培养基(GIBCO公司)常规培养。取对数生长期的PC-3M细胞，0.25%胰酶-EDTA消化并调节细胞密度以备接种。

　　1.1.2 实验动物 雄性裸鼠(BALB/c-nu/nu) 5只，4～6周龄，体重18～20 g，购于南京大学模式动物研究所。于恒温(25～27℃)、恒湿(40%～50%)的无菌净化的屏障系统内饲养，实验条件符合SPF要求。用高压灭菌的标准饲料和水供动物自由食用。

　　1.1.3 其他试剂 Her-2/neu单克隆抗体及EnVision两步法试剂盒(Dako REALTM EnVisionTM Detection System，Peroxidase/DAB，Rabbit/Mouse，K5007)为DAKO公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 制作细胞蜡块 将PC-3M细胞消化后用PBS洗涤2次，弃上清后加入95%乙醇2500 r/min离心15 min，室温静置2 h，弃乙醇，取固体物质常规脱水浸蜡包埋切片行苏木精-伊红染色及免疫组化染色。

　　1.2.2 动物接种 用生理盐水调节细胞密度为5×109/L、1×1010/L及2×1010/L。将5只裸鼠分为3组：1组(1只)，接种细胞数为2×106/只裸鼠;2组(2只)，接种细胞数为1×106/只裸鼠;3组(2只)，接种细胞数为0.5×106/只裸鼠。所有裸鼠均以100 μl的量接种于颈背部皮下。每3天观察裸鼠各种生活变化、移植瘤成瘤时间及生长情况。待完全成瘤后，颈椎脱臼法处死裸鼠，皮下剥离肿瘤组织，称重，测量瘤体长径及短径，标本用10%中性甲醛固定，石蜡包埋，4 μm切片，行苏木精-伊红染色及免疫组化染色，显微镜下观察。

　　1.2.3 EnVision两步法免疫组化染色 切片常规脱蜡至水，高压修复抗原(修复液为pH 8.0的1 mmol/L EDTA缓冲液),一抗(Her-2/neu，1∶500)4℃孵育过夜，Dako Rabbit/Mouse EnVision/HRP复合物室温孵育40 min，DAB镜下显色，苏木精衬染，常规脱水透明，中性树胶封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。

　　2 结 果

　　2.1 肿瘤生长情况 5只裸鼠全部存活，生长良好。细胞接种第17天1组1只、2组2只及3组1只裸鼠可触及皮下肿块，最大径1～3 mm;23天后所有裸鼠均成瘤，最大径2～6 mm。裸鼠移植成瘤达到100%(5/5只)，其中接种细胞浓度为1×1010/L及2×1010/L者成瘤更快。

　　2.2 裸鼠移植瘤病理形态 裸鼠移植瘤肿块经病理切片苏木精-伊红染色检查证实为恶性肿瘤组织(图1、2)。低倍镜下示肿瘤细胞弥漫分布，似肉瘤样改变，可见肿瘤性坏死，并浸润裸鼠皮下脂肪组织及横纹肌组织;高倍镜下肿瘤细胞呈梭形，胞质丰富、红染，核大，圆或卵圆形，染色质细，核膜清楚，核仁易见，核质比例增大，核分裂易见。

　　2.3 肿块Her-2/neu蛋白免疫组化检查 培养的PC-3M细胞蜡块及移植瘤的肿瘤细胞免疫组化染色示细胞表达Her-2/neu蛋白，细胞质及细胞膜上见棕黄色颗粒(图3、4)。图1 裸鼠移植瘤肿块病理形态(苏木精-伊红染色，×100)

　　3 讨 论

　　前列腺癌是老年男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一。在美国，前列腺癌的发病率占男性恶性肿瘤的第1位，居男性癌症相关性病死率的第3位。我国前列腺癌发病率虽远低于西方国家，但近20年来随着人口老龄化及生活条件的改善，发病率逐渐增加，其发病率在我国男性泌尿生殖系统恶性肿瘤中已跃居第3位[2]。因此，前列腺癌正逐渐成为我国临床关注的问题，成为研究的热点之一。

　　前列腺癌动物模型对研究前列腺癌的发病机制、肿瘤与宿主的关系、肿瘤侵袭与转移的过程和治疗措施的有效性等具有重要的作用。理想的前列腺癌动物模型应该模拟人前列腺癌发生、发展的过程,具备以下特点[3]：①起源于前列腺的背侧叶、中叶，生长速度比较缓慢，并多发于老龄动物;②肿瘤的恶性程度、转移特性、组织学特点和生物化学特性与人前列腺癌相似，且能模拟人前列腺癌基因的变化;③对激素的治疗反应与人前列腺癌相似。但是理想的前列腺癌动物模型非常难以建立，目前前列腺癌动物模型按照建立的方法分为4类[3-5]：①自发和诱发前列腺癌模型;②异种移植模型;③转基因小鼠模型;④基因敲除动物模型。以上每种动物模型各具有其优缺点，如自发性前列腺癌动物模型从其发生来看，同其他模型相比与人类肿瘤的发生更相似，影响肿瘤发生、发展的因素有可能被发现;但潜伏期较长，肿瘤发生、发展时间不一致，一方面使实验时间延长，另一方面对实验数据难以进行科学的统计学处理，因此在实际中应用较少。诱发性前列腺癌动物模型采用化学致癌剂或加用雄激素诱发前列腺癌，实验过程中可以观察到前列腺癌发生、发展及转移的动态过程;但诱发的过程一般较长，个体差异大，且肿瘤细胞的形态特征差别也很大，所以很少作为肿瘤药物治疗的动物模型，一般作为病因学研究、药物预防研究的模型。异种移植动物模型即用已建立的人前列腺癌细胞株种植于免疫缺陷动物体内所建立的动物模型。免疫缺陷动物系的建立是异种移植模型建立的基础，目前常用的动物包括裸鼠和重症联合免疫缺陷性小鼠(SCID小鼠)。自从胸腺缺失、T细胞免疫缺陷裸鼠建立以来，肿瘤异种移植模型的建立获得了巨大进展。由于裸鼠的免疫缺陷，作为人体肿瘤异种移植的受体，移植后生长良好，人类肿瘤在裸鼠移植瘤的形态和功能等特征与移植前基本相同，是肿瘤发病机制研究的理想动物模型。按照种植的部位可分为皮下种植、尾静脉种植、腹腔内种植和靶器官原位种植。这一类动物模型虽然在研究肿瘤发生的最初事件方面有一定缺陷，但此类模型在研究前列腺癌转移机制、药物疗效和前列腺癌由雄激素依赖性向非依赖性演进等方面还是有用的工具。使用较多、较方便的方法是用人前列腺癌肿块或人前列腺癌细胞株移植于裸鼠皮下，使之成为荷瘤鼠，进行一系列前列腺癌的体内实验研究。

　　研究发现，Her-2/neu在乳腺癌、卵巢癌、大肠癌、前列腺癌及肺癌等恶性肿瘤的发生、发展、治疗及预后中起着不同程度的重要作用。例如Her-2/neu在20%～30%的人乳腺癌中过表达，针对Her-2/neu蛋白的单克隆抗体已证明在Her-2/neu过表达的乳腺癌中有很明显的治疗作用。在前列腺癌中，已有研究认为Her-2/neu蛋白过表达可通过交叉激活AR引起肿瘤发生及发展[1]，为激素非依赖前列腺癌的研究提供了理论依据;前列腺癌患者中Her-2/neu蛋白过表达可作为临床病理参数用于预测前列腺癌的长期预后[6]。因此，选择表达Her-2/neu的前列腺癌细胞株及移植瘤动物模型有助于进行前列腺癌的实验研究。

　　培养细胞(包括贴壁生长和悬浮生长的细胞)的免疫组化染色一般采取细胞爬片或者细胞涂片，但常因细胞脱片及细胞膜的完整性一定程度上影响抗原与抗体的结合，从而影响免疫组化的检测结果，且在盖玻片上培养细胞操作较烦琐。本实验根据文献中将胸水细胞制成石蜡切片的方法[7]，将人前列腺癌PC-3M细胞制作成细胞蜡块，免疫组化染色效果良好，且蜡块可以长期保存、多次进行试验。本实验结果显示PC-3M细胞表达Her-2/neu蛋白。

　　本实验将人前列腺癌PC-3M细胞接种至裸鼠颈背部皮下， 采用不同细胞浓度接种均可成瘤。 接

　　种细胞密度为 1×1010/L及 2×1010/L者成瘤较快，于接种后17天均成瘤。接种的细胞密度为0.5×1010/L者虽可成瘤，但成瘤较慢，本实验中直至接种后23天才完全成瘤。因动物实验需要的细胞数较多，工作量较大，且希望接种后成瘤快，因此选择1×1010/L的细胞密度即可满足上述需要。PC-3M荷瘤裸鼠的移植瘤肿块病理切片苏木精-伊红染色显示恶性肿瘤的形态学特征并浸润裸鼠皮下脂肪组织及横纹肌组织。免疫组化染色发现移植瘤细胞与培养的PC-3M细胞一样，Her-2/neu蛋白呈阳性表达。因此，PC-3M细胞以1×1010/L接种浓度可建立裸鼠前列腺癌荷瘤模型，该移植瘤保留了恶性肿瘤的特征及PC-3M细胞表达Her-2/neu蛋白的特性，为研究Her-2/neu在前列腺癌中的作用及针对Her-2/neu的肿瘤治疗研究提供了较好的动物模型。

　　【参考文献】

　　[1] Craft N, Shostak Y, Carey M, et al. A mechanism for hormone-independent prostate cancer through modulation of androgen receptor signaling by the HER-2/neu tyrosine kinase [J]. Nat Med, 1999, 5(3): 280-285.

　　[2] 叶定伟,李长岭. 前列腺癌发病趋势的回顾和展望[J]. 中国癌症杂志, 2007, 17(3): 177-180.

　　[3] 王元天, 孙颖浩,钱松溪. 前列腺癌动物模型的建立和应用[J]. 临床泌尿外科杂志, 2002, 17(8): 235-237.

　　[4] Zhau HE, Li CL, Chung LW. Establishment of human prostate carcinoma skeletal metastasis models [J]. Cancer, 2000, 88(12 Suppl): 2995-3001.

　　[5] Ahmad I, Sansom OJ, Leung HY. Advances in mouse models of prostate cancer [J]. Expert Rev Mol Med, 2008, 10: e16.

　　[6] Isharwal S, Miller MC, Epstein JI, et al. Prognostic value of Her-2/neu and DNA index for progression, metastasis and prostate cancer-specific death in men with long-term follow-up after radical prostatectomy [J]. Int J Cancer, 2008, 123(11): 2636-2643.

　　[7] 段立疆,金锦善. 简易胸水细胞石蜡制片法[J].诊断病理学杂志, 2001, 8(3): 180.