盐酸戊乙奎醚对大鼠缺氧缺糖/复氧复糖海马脑片凋亡相关因子表达的影响

　　【摘要】 目的 研究盐酸戊乙奎醚(penehyclidine hydrochloride，PHC)对大鼠缺氧缺糖/复氧复糖海马脑片的保护作用及机制。方法 采用大鼠海马脑片缺氧缺糖/复氧复糖模型;分为正常组、缺氧缺糖/复氧复糖(H/R)组、PHC 2 μmol/L(PHC2组)、PHC 10 μmol/L(PHC10组)、PHC 50 μmol/L(PHC50组)、Sco 50 μmol/L(Sco50组)，测量各组LDH释放率，免疫组织化学法测定各组海马CA1区Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达。结果 PHC各组LDH释放率均较H/R组下降，以PHC50组效果最好(P<0.01)。PHC50组Bcl-2阳性细胞的表达和Bcl-2/Bax比值均较H/R组升高,Bax和Caspase-3阳性细胞表达均较H/R组降低(P﹤0.01)。Sco50组Bcl-2阳性细胞的表达和Bcl-2/Bax比值也较H/R组升高,Bax和Caspase-3阳性细胞表达均较H/R组降低(P﹤0.01)。结论 PHC可能通过减少LDH释放和Caspase-3、Bax的表达，增加Bcl-2的表达减轻大鼠缺氧缺糖/复氧复糖海马脑片的损伤。

　　【关键词】 海马脑片;缺氧缺糖/复氧复糖;盐酸戊乙奎醚;乳酸脱氢酶;大鼠

　　Effect of penehyclidine hydrochloride on the expression of apoptosis-correlated factors

　　in rat hippocampal slices in hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation

　　WANG Yun, MA Tengfei, SUN Xiaojing, WANG Yigang, QIN Wei, GU Shuling*

　　(Department of Pharmacology, Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China)

　　Abstract: Objective To investigate the protective effect of penehyclidine hydrochloride (PHC) on the apoptosis of rat hippocampal slices induced by hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation (H/R) and the underlying mechanism. Methods Experimental model of hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation/glucose reintroduction was established by adoption of rat hippocampal slices, which were equally divided into 6 groups: Control group, H/R group, PHC 2 μmol·L-1 (PHC2) group, PHC 10 μmol/L (PHC10) group, PHC 50 μmol/L (PHC50) group and Sco 50 μmol/L (Sco50) group. The LDH release rate was used to evaluate the protective effect of PHC on the apoptosis of rat hippocampal slices induced by H/R. The expression of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 in hippocampal CA1 field of each group were respectively detected by immunohistochemical method. Results Compared with H/R group, the LDH release rate in PHC groups decreased, with PHC50 group on the top; the expression of Bcl-2 positive cells and the Bcl-2/Bax ratio in PHC50 group increased; and the expression of Bax and Cspae-3 positive cells decreased (P<0.01). Compared with H/R group, the expression of Bcl-2 positive cells and the Bcl-2/Bax ratio in Sco50 group increased; and the expression of Bax and Cspae-3 positive cells decreased (P<0.01). Conclusion PHC might attenuate the H/R-induced injuries to hippocampal slices by reducing the release rate of LDH, the expression of Caspase-3 as well as Bax and increase the expression of Bcl-2.

　　Key words: hippocampal slices; hypoxia/hypoglycemia and reoxygenation; penehyclidine hydrochloride; lactate dehydrogenase; rat

　　缺血性脑损伤发病机制非常复杂，近年认为脑缺血早期伴随着乙酰胆碱(acetylcholine，Ach)大量释放，通过激动毒蕈碱M型胆碱受体加重脑损伤[1]。M型胆碱受体通常可将其分为 M1～M5 5个亚型。M1受体主要存在于突触后膜，过度激活后可出现慢兴奋性突触后电位，产生兴奋性毒性作用。M2受体主要存在于突触前膜，对Ach释放产生负反馈调节作用，阻断M2受体会导致Ach的释放增多。因此，寻找选择性拮抗M1受体亚型而对M2受体亚型没有明显作用的抗胆碱药物可以成为治疗缺血性脑损伤的策略之一。

　　盐酸戊乙奎醚(penehyclidine hydrochloride，PHC)主要选择性拮抗M1、M3受体，对M2受体无明显作用，具有较强的中枢抗胆碱作用[2]。我们前期研究表明其对缺血性脑损伤具有保护作用[3]。但具体机制尚不明确，尤其是在海马脑片水平研究PHC对缺氧缺糖/复氧复糖后细胞凋亡相关因子Caspase-3、Bcl-2、Bax等表达的影响鲜有报道。因此，本实验以非选择性M受体阻断药盐酸东莨菪碱(scopolamine hydrochloride，Sco)为对照，通过研究PHC对大鼠海马脑片脑缺血/再灌注损伤后凋亡相关因子的表达，探讨PHC对脑缺血的保护机制，为拓宽该药临床应用提供理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物与试剂 成年雄性SD大鼠，体重250～300 g，由徐州医学院实验动物中心提供。Caspase-3抗体、SP试剂盒购自武汉博士德公司，Bcl-2和Bax抗体购自美国Santa Cruz公司。盐酸东莨菪碱购自美国Sigma公司，盐酸戊乙奎醚购自成都力思特制药公司。常规人工脑脊液(nACSF)的配制(mmol/L)：NaCl 125、KCl 5、NaH2PO4 1.2、MgSO4 2.0、NaHCO3 25.7、CaCl2·H2O 2.0、葡萄糖10。无糖ACSF：以蔗糖10 mmol/L代替葡萄糖。无钙ACSF：MgSO4 10 mmol/L，无CaCl2·H2O。以上均调定pH=7.4。

　　1.2 主要仪器 McIlwain组织切片机(英国MICKLE公司)，KD-Ⅱ型冰冻切片机(浙江金华科迪仪器设备公司)，2300型CO2孵箱(美国Sheldon公司)，三气培养箱(美国Thermo公司)，752分光光度计(上海分析仪器厂)。

　　1.3 模型制备 大鼠乙醚麻醉，断头处死，立即将头浸入0℃的生理盐水中，迅速取脑，浸入预通纯氧饱和的改良人工脑脊液(mACSF，4℃)中。分离海马，将海马在组织切片机上切成400 μm厚的脑片，然后将脑片移入37℃的nACSF。在CO2孵箱中平衡60 min。然后将脑片移入已预先通气(95%N2，5%CO2)的无葡萄糖ACSF，再通入94%N2，5%CO2，1%O2孵箱中37℃孵育90 min。取出脑片移入含葡萄糖nACSF，CO2孵箱中37℃孵育60 min，造成缺氧缺糖/复氧复糖，模拟人脑缺血再灌注损伤。

　　1.4 实验分组 脑片分为：①正常组，②模型(H/R)组，③PHC 2 μmol/L(PHC2)组，④PHC 10 μmol/L(PHC10)组,⑤PHC 50 μmol/L(PHC50)组,⑥Sco 50 μmol/L(Sco50)组。③～⑥组分别于缺氧前加入相应剂量的PHC，①～②组加入等体积nACSF，孵育30 min。取①～⑤组孵育液测乳酸脱氢酶(LDH) 释放率;①、②、⑤、⑥组用SP法检测海马CA1区Caspase-3、Bax、Bcl-2的表达。

　　1.5 LDH释放率的测定 在0.5 ml基质液中分别加入各组100 μl上清孵育液和100 μl 11.3 mmol/L尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(空白管不加),37℃孵育15 min,加入1 mmol/L 2,4-二硝基苯肼0.5 ml,37℃保温15 min,加入5 ml 0.4 mol/L NaOH终止反应。空白管调零点,440 nm波长处测光密度值。脑片匀浆后离心取上清液测定总LDH，LDH释放率以脑片释放于孵育液中的LDH占总LDH的百分比(LDH%)表示[4]。

　　1.6 SP法步骤 缺氧缺糖/复氧复糖后脑片浸入4%多聚甲醛中固定6 h，连续海马冠状冰冻切片，片厚25 μm，进行免疫组织化学反应：①蒸馏水冲洗冰冻切片，PBS浸泡5 min;3%H2O2室温孵育5～10 min，消除内源性过氧化物酶的活性;②封闭液室温孵育10～15 min，倾去，勿洗;③滴加一抗稀释液，放置4℃冰箱过夜;④滴加生物素化羊抗兔二抗工作液，室温孵育10～15 min;⑤滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，室温孵育10～15 min;⑥DAB显色，镜下控制反应时间，双蒸水终止反应。充分洗涤后贴片、晾干、脱水、透明、中性树胶封片，显微镜观察并拍照。第③～⑥步骤后均用PBS洗(5 min×3次);Caspase-3、Bcl-2、Bax一抗稀释比例均为1∶200。DAB按说明书使用;空白对照切片用抗体稀释液代替一抗孵育，其他反应步骤相同。光镜下观察到胞质内有棕黄色颗粒者为阳性细胞，切片采用阳性细胞数计数进行半定量测定。每张脑片选取CA1区相同部位的2个视野，将每个视野在高倍镜下观察到的阳性细胞总和取平均，以阳性神经元数/高倍镜视野(个/HP)表示。

　　1.7 统计学处理 所有数据均用SPSS 13.0软件进行分析。多组间比较用方差分析法(ANOVA)，两组间比较采用SNK法。P<0.05认为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 PHC对LDH释放率的影响 H/R组LDH释放率高于正常组;与H/R组相比，PHC各组LDH释放率均降低，且随着剂量的增加，作用逐渐增强(表1)。表明PHC能够降低LDH释放率。　表1 不同剂量PHC对大鼠缺氧缺糖/复氧复糖海马脑片LDH释放率的影响

　　2.2 PHC对大鼠缺氧缺糖/复氧复糖海马脑片凋亡相关蛋白表达的影响 H/R组Bcl-2、Bax、Caspase-3阳性细胞表达均高于正常组,而Bcl-2/Bax比值低于正常组;与H/R组相比，PHC50组和Sco50组Bcl-2阳性细胞的表达和Bcl-2/Bax比值升高,Bax和Caspase-3阳性细胞表达降低，但幅度没有PHC50组明显。说明PHC对以上指标的影响能力大于Sco(表2)。　表2 PHC对大鼠缺氧缺糖/复氧复糖海马脑片凋亡相关蛋白表达的影响

　　3 讨 论

　　海马对缺血损伤非常敏感，也是与学习记忆关系最为密切的脑区。本实验采用大鼠海马脑片模拟人脑缺血/再灌注损伤模型，与在体实验动物模型相比，此脑片更易控制实验条件,排除了许多生理影响因素的干扰。LDH作为细胞内标志酶，当受损神经元由于膜通透性改变时，LDH漏出量明显增加。LDH释放率能很好地反映细胞损伤的程度。本实验结果显示，PHC明显降低大鼠海马脑片的LDH释放率，提示PHC对缺血性脑损伤可能有良好的保护作用。并且在PHC 50 μmol/L时效果最好，所以选择PHC 50 μmol/L进行机制作用探讨，同时以等摩尔浓度的Sco 50 μmol/L作对照。

　　凋亡在缺血性脑损伤过程中起重要作用。目前认为至少有两类基因与细胞凋亡的调控密切相关：一类为抑制细胞凋亡作用的Bcl-2、Bcl-xL[5]，另一类为促进细胞凋亡作用的Bax、Bad、Bak等[6]。脑缺血发生时，通过触发这些基因的转录和翻译,生成相应的蛋白表达产物，引起细胞内一系列生化及结构改变,导致细胞凋亡[7]。另有研究表明，促细胞凋亡和抗细胞凋亡成员间的平衡影响着细胞凋亡的发生。其中Bcl-2与Bax的比值在中枢神经细胞凋亡中起关键作用[8],比值高,细胞存活率高，比值低,细胞存活率低。Caspase-3是Caspase级联瀑布下游最关键的凋亡蛋白酶,它通过介导和执行死亡指令，在缺血神经元凋亡的信息传递中处于核心位置，被认为是细胞凋亡蛋白级联反应的必经之路[9]。本实验研究发现，大鼠海马脑片模拟人脑缺血/再灌注损伤后Bax、Caspase-3表达增加，Bcl-2的表达减少，Bcl-2/Bax比例则降低;而PHC能降低损伤后Bax、Caspase-3的表达，增加Bcl-2的表达，并且使Bcl-2/Bax比例升高，提示PHC能减轻脑缺血后兴奋性毒性引起的细胞凋亡。

　　在本实验中，Sco对脑缺血有一定保护作用，且各指标影响趋势同PHC，但效果不如PHC。可能因为东莨菪碱是非选择性拮抗剂，阻断M1、M3受体的同时阻断M2受体，增加Ach的释放，部分消减了东莨菪碱的作用。由于脑缺血损伤机制非常复杂，PHC对脑缺血损伤的保护作用也是多方面的，因此对于其作用机制的探讨还有待于进一步深入。

　　【参考文献】

　　[1] Kumagae Y, Matsui Y. Output, tissue levels, and synthesis of acetylcholine during and after transient forebrain ischemia in the rat [J]. J Neuorchem，1991,56(4):1169-1117.

　　[2] Han XY, Liu H, Liu CH, et al. Synthesis of the optical isomers of a new anticholinergic drug, penehyclidine hydrochloride (8018) [J]. Bioorg Med Chem Lett，2005,15(8):1979-1982.

　　[3] 马腾飞,靳榕,张晶,等.盐酸戊乙奎醚对沙土鼠前脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国临床药理学与治疗学,2006,11(4):453-457.

　　[4] Koh JY, Choi DW. Quantitative determination of glutamate mediated cortical neuronal injury in cell culture by lactate dehydrogenase efflux assay [J]. J Neurosci Methods,1987,20(1):83-90.

　　[5] Antonsson B. Bax and other pro-apoptotic Bcl-2 family “killer-proteins” and their victim the mitochondrion [J]. Cell Tissue Res,2001,306(3):347-361.

　　[6] Adams JM, Cory S. Bcl-2-regulated apoptosis: mechanism and therapeutic potential [J]. Curr Opin Immunol,2007,19(5):488-496.

　　[7] Chipuk JE, Kuwana T, Bouchier-Hayes L, et al. Direct activation of Bax by p53 mediates mitochondrial membrane permeabilization and apoptosis [J]. Science,2004,303(5660):1010-1014.

　　[8] Shimizu S, Narita M, Tsujimoto Y. Bcl-2 family proteins regulate the release of apoptogenic cytochrome c by the mitochondrial channel VDAC [J]. Nature,1999,399(6735):483-487.

　　[9] Broughton BR, Reutens DC, Sobey CG. Apoptotic mechanisms after cerebral ischemia [J]. Stroke,2009,40(5):e331-e339.