生长抑素对溃疡性结肠炎大鼠细胞因子的影响

　　【摘要】 目的 观察生长抑素(奥曲肽)对溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)大鼠肠黏膜组织中细胞因子的影响，探讨其对UC大鼠的保护作用及其机制。方法 雌性SD大鼠随机分为正常对照组、奥曲肽对照组、模型组、治疗组，每组7只。模型组、治疗组大鼠用三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇溶液灌肠复制UC模型。观察各组实验大鼠体质量变化、大体及组织病理学改变。采用酶联免疫吸附法检测白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量。结果 奥曲肽可以缓解大鼠体质量的减轻，减少腹泻及便血的发生;并且能够显著改善结肠组织大体和组织学评分，降低IL-6、TNF-α的表达，同时使IL-10的表达增加。结论 奥曲肽对TNBS诱导的大鼠UC具有显著保护作用，其作用机制可能与下调促炎细胞因子及上调抗炎细胞因子的产生和表达有关。

　　【关键词】 溃疡性结肠炎;生长抑素;肿瘤坏死因子-α;白细胞介素-6;白细胞介素-10

　　Effects of somatostatin on cytokines in rats with TNBS-induced ulcerative colitis

　　CHEN Jianqun， LIU Yuanshan， ZHU Bingxi*

　　(Department of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002, China)

　　Abstract: Objective To investigate the effects of somatostatin (octreotide) on the cytokine produced by colonic mucosa and to explore its possible mechanisms in the protection of TNBS-induced ulcerative colitis (UC) in rats. Methods 28 female SD rats were randomized into normal control group, octreotide control group, model group and treatment groups (n=7). UC in model group and treatment group was induced by intrarectal administration of TNBS (100 mg/kg in 50% ethanol). Octreotide 50 ug/kg (octreotide control group and treatment group) or saline 1 ml (normal control group and model group) was administered intraperitoneally daily for 14 days. All animals were killed on day 15. The body weight loss of each rat, macroscopical and histological changes of the colon were observed. The levels of IL-6, IL-10 and tumor necrosis factor α (TNF-α) in colon supernatant were determined by ELISA. Results Compared with model group, octreotide significantly inhibited the body weight loss and occurrence of diarrhea and rectal bleeding and obviously reduced colon mucosal IL-6 and TNF-α expression level. The macroscopic score, microscopic score and the expression of IL-10 were significantly improved in the octreotide treatment group. Conclusion Octreotide has noticeable protective effects on TNBS-induced ulcerative colitis in rats. The possible mechanism might be related to the downregulation of the expression of proinflammatory cytokines and the upregulation of the expression of anti-inflammatory cytokines.

　　Key words: ulcerative colitis; somatostatin; tumor necrosis factor α; interleukin-6; interleukin-10

　　溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是病因和发病机制未确定的慢性非特异性肠道炎症性疾病。越来越多的研究表明免疫因素是其最基本的发病机制，细胞因子的研究对探讨UC的病因、发病机制、治疗均具有重要的意义，促炎性细胞因子与抗炎细胞因子间的平衡失调被认为是UC的一个重要发病机制[1-2]。传统药物对UC疗效不甚理想，特别是对部分顽固性、复发性或重症患者，至今还没有理想的治疗方法，筛选高效低毒的抗炎药物一直是该领域的研究热点。生长抑素(somatostatin，SST)是在1973年首先从下丘脑分离出来的一个具有14个氨基酸的肽类激素，功能主要是抑制胃肠分泌，抑制炎症介质的产生，同时对免疫系统也有多种调节作用。国内曾有生长抑素治疗激素依赖型重症溃疡性结肠炎的成功报道[3]。本实验应用三硝基苯磺酸(TNBS)复制UC模型，观察生长抑素类似物奥曲肽(善宁)对UC模型大鼠肠组织病理改变、炎性损伤及结肠组织中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-10(IL-10)表达的影响, 探讨奥曲肽对UC的保护作用及可能的机制，从而为奥曲肽治疗UC患者提供一定的实验基础和理论依据，为UC的临床治疗探寻新的途径。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物、材料和试剂 健康雌性SD大鼠28只，体质量170～210 g，清洁级，由徐州医学院实验动物中心提供。TNBS购自Sigma公司;奥曲肽(善宁)由瑞士诺华公司提供;大鼠IL-6、IL-10、TNF-αELISA试剂盒均购自上海西唐生物科技有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物模型制备和分组 取清洁级雌性SD大鼠28只，随机分为正常对照组(Normal)、奥曲肽对照组(Oct)、模型组(Model)及治疗组(Toct)，每组7只。正常对照组及奥曲肽对照组不造模，模型组及治疗组均按Morris等[4]采用的方法建立TNBS结肠炎动物模型。各组大鼠实验前禁食(不禁水)24 h，实验时，腹腔注射10%的水合氯醛使大鼠轻微麻醉，而后将一直径2.0 mm、长约12 cm的硅胶管用石蜡油润滑，由肛门轻缓插入大鼠体内深约8 cm，缓慢注入含100 mg/kg TNBS的等容积无水乙醇溶液，然后提起大鼠尾部，持续倒置10 min，使造模剂充分渗入大鼠肠腔内。造模后，自然清醒，自由饮食。

　　1.2.2 给药方法 根据人与大鼠药物剂量折算系数及结合国外相关文献报道，奥曲肽对照组与治疗组大鼠每天给予50 μg/kg的奥曲肽，用生理盐水稀释至1 ml，由腹腔注入;正常对照组及模型组大鼠每天腹腔注射生理盐水1 ml。连续给药14天后处死所有大鼠并取样。

　　1.2.3 症状观察 每天对各组大鼠进行称重并记录，每日观察各组大鼠精神状态、进食、活动、腹泻情况及粪便性状等。

　　1.2.4 标本采集 水合氯醛麻醉后处死大鼠，打开腹腔，截取自肛门向上10 cm的结肠，沿肠系膜纵轴剪开，冰生理盐水反复冲洗干净，在滤纸上将肠黏膜面向上展开，参照文献[5]肉眼观察大体形态并评分。然后以病灶为中心纵轴切开分成两部分：一部分以10%甲醛固定，常规石蜡包埋，苏木精-伊红染色，参照文献[5]进行病理组织切片观察及组织学评分。另切取部分病变结肠组织，滤纸吸干，称重后置-70℃冰箱冻存，为组织待测标本。

　　1.2.5 结肠组织IL-6、IL-10、TNF-α检测 精确称取备用的结肠组织0.1 g，尽快剪碎后，置于匀浆器中用9倍生理盐水匀浆(匀浆器末端置于放冰块的冷水中)，以3500 r/min离心10 min，取上清液。采用双抗体夹心ELISA法，严格按试剂盒说明书进行操作。

　　1.2.7 统计学处理 数据采用均值±标准差(±s)表示。运用SPSS 16.0软件进行统计学处理，组间采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 生长抑素对TNBS模型大鼠一般状态的影响 正常组及奥曲肽组大鼠反应较灵敏，毛发有光泽，饮食正常，无腹泻及便血;模型组大鼠则表现为精神萎靡、少动，毛发杂乱无光泽，饮食量减少，出现腹泻和便血。与模型组相比，治疗组大鼠一直未出现肉眼血便。

　　2.2 生长抑素对TNBS模型大鼠体质量的影响 正常组及奥曲肽组大鼠禁食24 h后，体质量轻微降低，随后2周体质量逐渐恢复并增加至原体质量的120%，2组大鼠间体质量变化无显著性差异(P<0.05)。模型组大鼠体质量在第2天降至最低，只有原体质量的83%，随后2周内逐渐增加至最初体质量的103%，且在2周内体质量显著低于正常组及奥曲肽组大鼠的体质量(P<0.05)。而治疗组大鼠的体质量在第2天就开始恢复，7～8天即恢复。见图1。以上结果表明，生长抑素能够有效缓解造模后大鼠体质量的下降，促进大鼠体质量的尽快恢复。

　　图1 生长抑素对TNBS模型大鼠体质量的影响

　　2.3 结肠大体形态、组织损伤及评分 模型组大鼠结肠黏膜明显充血、水肿，部分与周围组织粘连，距肛门8 cm范围内可见较大溃疡病灶，局部肠管扩张，肠壁增厚、颜色灰暗，病灶处有假膜样物覆盖。光镜下可见黏膜上皮坏死脱落、溃疡形成，固有层内有大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润，纤维组织增生。治疗组肠黏膜上皮脱落缺损较轻,溃疡区域减少,黏膜周围上皮可见增生修复,炎症细胞浸润减少,表现出明显的治疗作用。正常对照组及奥曲肽组结肠黏膜完整，固有层内肠腺丰富，排列紧密。见图2。各组别结肠大体形态和组织学损伤评分具体结果见表1。表1 各组大鼠结肠组织大体形态、组织学评分比较

　　2.4 结肠黏膜细胞因子表达情况 与正常组比较，模型组大鼠结肠黏膜IL-6、TNF-α表达明显升高(P<0.01) ;IL-10表达明显下降(P<0.01);与模型组比较，治疗组大鼠结肠黏膜IL-6、TNF-α表达均明显降低(P<0.01)，IL-10表达明显升高(P<0.01)，差异有统计学意义。见表2。表2 各组大鼠结肠粘膜细胞因子表达情况与正常对照组比较：*P<0.01;与模型组比较：#P<0.01

　　3 讨 论

　　UC是临床上常见的一种反复发作的疾病，被世界卫生组织列为现代难治病之一，且与结肠癌关系密切。其确切病因和发病机制迄今未明。有学者[6]认为，可能与遗传、免疫、感染、环境等多种因素有关，其中细胞因子在溃疡性结肠炎发病中的作用备受重视。UC时肠黏膜促炎细胞因子(如：IL-1、IL-6、TNF-α等)表达升高，而抗炎细胞因子(如：IL-4、IL-10、IL-13等)分泌相对不足，使肠黏膜产生过强的炎症反应，从而引起肠道损伤。

　　促炎细胞因子TNF-α、IL-6主要由激活的单核-巨噬细胞分泌，它们的许多生物学作用是相同的，但也各有其特点。TNF -α在溃疡性结肠炎发病中被公认为是一种促炎细胞因子，它可以促使肠上皮内淋巴细胞增殖、分化及移行，这一过程会释放大量的特异性或非特异性炎症分子，起到局部免疫破坏作用，反映到UC则是肠局限性溃疡的出现和延续[7]。而IL-6异常则可以导致一些免疫炎性疾病的发生，它的过度增高可导致机体内环境紊乱，诱发或加重某些疾病[8]。已有报导多认为IL- 6在溃疡性结肠炎中浓度明显增高[9-10]。IL-10又名细胞因子合成抑制因子,其主要生物学作用是抑制活化的单核-巨噬细胞转录分泌IL-1、IL -6和TNF-α等，在维持正常肠道黏膜免疫调节与稳定肠道黏膜内环境中发挥重要作用。有研究发现用IL-10灌肠治疗UC患者，能明显改善肠道黏膜炎症[11]。本实验结果显示，奥曲肽能显著降低大鼠UC模型结肠组织促炎细胞因子IL- 6、TNF-α的含量，同时明显升高结肠黏膜IL-10的含量(P<0.01)，奥曲肽治疗组结肠组织大体形态、组织学评分指数明显降低(P<0.01)。因此，从奥曲肽治疗后细胞因子发生的改变，推测奥曲肽可能总体上能够调节细胞因子网络的平衡，即抑制促炎细胞因子(如IL-6、TNF -α)的表达, 促进抗炎细胞因子(如IL-10)的分泌，使免疫功能恢复正常，控制持续扩大的炎症反应，从而减轻大鼠实验性结肠炎的肠道损伤，达到治疗结肠炎症的目的。

　　UC时促炎细胞因子分泌过多，抑炎细胞因子分泌相对不足，导致促炎/抑炎细胞因子失衡，在UC发病机制中具有重要的作用，是产生肠道非特异性炎症反应的关键环节，本研究表明阻断这一关键环节当属比较理想的治疗途径。目前一些针对细胞因子失衡的免疫调节治疗已经在动物模型上取得了较好效果，并开始试验性的应用于临床。促炎细胞因子拮抗剂如IL-1抑制剂可以阻断实验性结肠炎模型动物的形成，并存在量效依赖关系[12]。抗TNF -α治疗UC患者已有临床试验报道，并取得良好疗效，但是尚有待于大规模的临床试验证实[13]。重组抑炎细胞因子的治疗，主要是通过补充IL-10的方法来实现，Nakase等[14]将能持续释放 IL-10的明胶微粒局部应用于小鼠直肠，结果显示其疗效优于全身应用IL-10。

　　总之，本研究说明奥曲肽具有一定的止泻、抗炎和减轻肠黏膜损伤的作用，从而能有效防止大鼠实验性结肠炎的发生及发展。其作用机制可能与其下调促炎细胞因子上调抗炎细胞因子的产生和表达， 调节细胞因子的网络平衡有关。虽然UC的发病是复杂的、多环节、多因素相互作用的结果，UC时细胞因子之间的相互作用和产生细胞因子失衡的机制也有待于进一步研究，但是目前认为细胞因子失衡是UC产生肠道非特异性炎症的关键环节， 围绕这一关键环节的免疫调节治疗，调节细胞因子失衡并重建平衡的策略，必将为UC的临床治疗带来新的启示。

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