邻苯二甲酸二异辛酯对雄性小鼠主要脏器及生殖功能的影响

　　【摘要】 目的 观察邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)对雄性小鼠主要脏器及生殖功能的影响。方法 将5～6 周雄性小鼠24只随机分为4组，每组6只，对照组不做任何处理，低剂量组皮下注射DEHP 100 mg·kg-1，中剂量组皮下注射DEHP 300 mg·kg-1，高剂量组皮下注射DEHP 500 mg·kg-1;每日1次，连续20 d,停止给药3 d后全部颈椎脱臼处死。测定小鼠体质量、主要脏器重量、精子活动率、精子存活率及精子畸形率。结果 低剂量组、中剂量组小鼠肝脏系数与对照组比较差异显著(P<0.05)，高剂量组小鼠肝脏系数与对照组比较差异极显著(P<0.01)。低剂量组、中剂量组、高剂量组的精子活动率和存活率随剂量的增加有明显下降趋势。低剂量组、中剂量组、高剂量组畸形数目随剂量的增加逐渐增多。结论 DEHP能明显引起小鼠肝脏及生殖功能受损。

　　【关键词】 邻苯二甲酸二异辛酯 雄性小鼠 脏器 生殖功能

　　Effect of di(2ethylhcxyl)phthalate on main organ and reproductive function of male mice

　　YU Leyun,WANG Mengxia,QIN Liyuan,et al

　　1.Grade 2005,College of Basic Medicine,Xinxiang Medical College,Xinxiang 453003,China;

　　2.Grade 2005,Sanquan College,Xinxiang College,Xinxiang 453003,China

　　Abstract: Objective To investigate the effect of di(2ethylhexyl) phthalate (DEHP)on main organ and reproductive function of male mice.Methods Twentyfour male mice were randomly divided into 4 groups,6 mice for each group.Control group do nothing.Low dosage group,middle dose group and high dose group were injected DEHP 100 mg·kg-1,300 mg·kg-1 and 500 mg·kg-1 with hypodermic，respectively.Once two day for 20 days.On the third day after stopping giving medicine,killed the mice with cervical dislocation.The weight of mice and main organ,the reactivity and survival ratio of spermatozoa,the rate of teratospermia were detected.Results Compared with Control group,there was difference of liver coefficient in low dose group and middle dose group(P<0.05),and there was significantly difference in high dose group(P<0.01).The reactivity and survival ratio of spermatozoa decreased obviously when the dose of di(2ethylhcxyl)phthalate increased.The number of teratospermia was higher when the dose of di(2ethylhcxyl)phthalate increased.Conclusion DEHP can cause the damage of rat’s liver and reproductive function.

　　Key words: Di(2ethylhexyl) phthalate;male mice;organ;reproductive function

　　近几年，发现人群中精子数普遍降低，科学家们怀疑与环境中某些干扰物可能有关，提出了“环境内分泌干扰物”的概念[12]。对于这方面的研究有壬基酚[34]、邻苯二甲酸二辛酯和邻苯二甲酸二丁酯[5]及氯乙烯[6]等。邻苯二甲酸二异辛酯[Di(2ethylhexyl)phthalate,DEHP]属于邻苯二甲酸酯类是一种无色黏性液体微有气味，常用做气相色谱固定液、不饱和化合物及含氧化合物的增塑剂。邻苯二甲酸酯类对动物造成的影响目前研究多通过灌胃方式进行染毒，由于日常生活中人类大多通过皮肤接触本类药品，因此本实验采用皮下注射染毒方式，研究DEHP对小鼠主要脏器、生殖系统的发育和精子活动率、存活率、畸变率的影响。以验证人们日常使用的含有DEHP的化妆品、塑料用品等是否对人类的不孕不育有影响，同时也为今后这方面的研究和生活用品的制备提供一些可以参考的数据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　雄性健康昆明种小鼠24只，5～6周龄，体质量(28.0±2.0)g。由新乡医学院实验动物中心提供。

　　1.2 实验试剂与仪器

　　DEHP,纯度99%,上海化学试剂公司生产;DK981型水浴箱(天津市泰斯特仪器有限公司)，TDL802B型离心机(上海安亭科学仪器厂)YS100型显微镜(ChinaNikon)。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 动物处理

　　随机将24只小鼠分为4组，每组6只，对照组不做任何处理，低剂量组皮下注射DEHP 100 mg·kg-1，中剂量组皮下注射DEHP 300 mg·kg-1，高剂量组皮下注射DEHP 500 mg·kg-1，除对照组外，其他各组小鼠皮下注射各剂量组药物溶液或者稀释溶剂，2日1次，连续20 d，并且每天在相同的时间称体质量，在停止染毒后的第3天将小鼠全部颈椎脱臼处死。

　　1.3.2 主要脏器的测定

　　将处死小鼠的肝脏、肾脏、脾脏、睾丸、附睾立即取出，称湿重并计算脏器系数(脏器系数=脏器湿重/动物体质量)。

　　1.3.3 精子悬液的制备

　　将称完湿重的右侧附睾立即放入盛有5 mL 37 ℃生理盐水的平皿中，用眼科剪纵向剪开7～9个切口，让精子自由游出，放入37 ℃恒温水浴箱中30 min，用1层擦镜纸过滤除去附睾组织制得精子悬液。

　　1.3.4 精子活动率

　　将制备好的精子悬液取1～2滴，滴于清洁的载玻片上，在(20±2)℃的室温下，用普通光学显微镜，在10×10倍镜下肉眼观察每只鼠500个精子的活动力，在10 min内完成，精子活动状态按精子游泳状态分为4级[7]，Ⅰ级：运动活泼，直线游动;Ⅱ级：运动欠活泼，直线运动;Ⅲ级：原地旋转;Ⅳ级：毫无活动力。精子活动率(%)=(Ⅰ级+Ⅱ级+Ⅲ级)精子数目/(Ⅰ级+Ⅱ级+Ⅲ级+Ⅳ级)精子数目×100%。

　　1.3.5 精子存活率的计算

　　精子存活率的计算参照文献[8]。吸取0.5mL精子悬液放入干净试管中，再加质量分数0.4%台盼蓝染液0.5 mL用吸管轻轻吹打混匀，染色2 min，然后制片，显微镜检查，计数，染为蓝色的为死细胞，透明未染色的是活细胞，随机计数100个，计算出死活细胞的比例，重复计数1次，以2次观察结果的平均值作为活细胞的百分比值。

　　1.3.6 精子形态学观察

　　精子形态学观察方法参照文献[9]。将称完质量的左侧附睾立即放入盛有5 mL 37 ℃生理盐水的平皿中，用眼科剪剪碎，放入37 ℃水浴箱中温育20 min，使其充分游离，然后将精子悬液通过4层擦镜纸过滤，除去组织块，将滤液以1 000 r·min-1离心5 min后，弃去上清液后与沉淀混匀，滴片(每只小鼠制片2张)待玻片自然干燥后，用体积分数35%的甲醇固定5 min，再用体积分数2%伊红染色1 h，自来水冲去玻片上多余的染液，晾干后高倍镜下观察，每片检查精子200个。

　　1.4 统计学处理

　　实验数据以均数±标准(±s)表示，组间比较用方差分析，精子畸形率的比较采用χ2检验。

　　2 结果

　　2.1 DEHP对小鼠精子活动率和存活率的影响

　　低剂量组、中剂量组、高剂量组的精子活动率和精子存活率与对照组相比均有明显差异(P<0.01)，且精子的活动率和存活率随剂量的增加有明显下降趋势，见表1。表1 各组小鼠精子活动率和精子存活率的比较(略)

　　2.2 DEHP对小鼠主要脏器的影响

　　低剂量组、中剂量组小鼠肝脏系数与对照组比较差异显著(P<0.05)，高剂量组小鼠肝脏系数与对照组比较差异极显著(P<0.01)。低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠的脾脏系数和肾脏系数与对照组比较差异无统计学意义，但随着剂量的增加有升高趋向。低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠的睾丸脏器系数和附睾的脏器系数与对照组比较均无统计学意义，但附睾脏器系数随剂量的升高逐渐降低。见表2。表2 各组雄性小鼠脏器系数的变化(略)

　　与对照组比较aP<0.05，bP<0.012.3 DEHP对小鼠精子畸形率的影响 低剂量组畸形率和对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。中剂量组畸形率和对照组比较差异显著(P<0.05),高剂量组畸形率和对照组比较差异极显著(P<0.01),精子畸形的构成比中尾折叠所占比例最大，低剂量组68.42%，中剂量组71.50%，高剂量组61.31%。低剂量组、中剂量组、高剂量组畸形数目随剂量的增加逐渐增多。具体畸形构成比及数据见表3。表3 小鼠精子畸形率和各类精子畸形构成比(略)

　　3 讨论

　　DEHP是邻苯二甲酸酯类中的一种，邻苯二甲酸酯类普遍用做驱虫剂和杀虫剂的载体和化妆品，涂料，农药的溶剂，DEHP用量较大占邻苯二甲酸酯类用量的25%，本实验通过观察DEHP对雄性小鼠主要脏器重量的影响及生殖功能的影响。DEHP可以使小鼠肝脏重量变大，在较低剂量即可引起肝脏重量变大，由于肝脏是动物的主要解毒器官，因此DEHP可能有毒性，可以使肝细胞内水分增多，肝细胞变性坏死[10]。DEHP不能引起成年小鼠睾丸和附睾重量明显变化，但随着剂量的加大有明显降低的趋势。有研究报道DEHP能诱导未成年大鼠的睾丸毒性，处于发育期的雄性大鼠明显高于成年雄性大鼠[11]，可能是由于DEHP会影响生殖系统的发育。由于本次实验采用的是成年小鼠，因此对于未成年小鼠的发育毒性还有待后期实验进一步研究。DEHP可以降低精子的活动率和存活率，由于其内分泌干扰作用[1]，可降低睾丸内睾酮水平，从而干扰了下丘脑-垂体-性腺轴[12]，进而影响精子正常存活所需的酶类[13]，导致精子的活动率和存活率降低。DEHP高于100 mg·L-1可能导致所有组织器官形态发育异常[14],DEHP具有抗雄激素作用[11]，可以诱导精子发生突变，增高精子畸形率。经皮下注射吸收后的代谢产物目前不是十分清楚，因此其干扰精子的机制还有待进一步研究。

　　本实验显示大剂量DEHP能明显影响小鼠生长发育，较小剂量即可导致生殖功能的下降，提示人们在日常生活中尽量少使用含DEHP的塑料用品及化妆品，同时为提高生育质量和降低出生缺陷提供理论依据。

　　【参考文献】

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