蛛网膜下腔注射pEGFPC3hPPE的表达部位及生物学作用

　　【摘要】 目的 观察蛛网膜下腔注射pEGFPC3hPPE后脑啡肽表达的部位及生物学作用。方法 取SD大鼠30只随机分为实验组、空质粒对照组与对照组，实验组注射pEGFPC3hPPE，空质粒组注射pEGFPC3，对照组仅作假手术，注射后2 d开始观察各组大鼠的痛觉热敏变化，8 d后注射纳洛酮观察对脑啡肽的拮抗作用，并通过绿色荧光蛋白的表达观察质粒被组织细胞摄取并表达的部位。 结果 实验组大鼠自术后4 d起痛觉热敏反应时间明显延长，大鼠软脑膜、软脊膜及脊神经外膜上发现绿色荧光蛋白的表达。结论 pEGFPC3hPPE能被大鼠软脑膜、软脊膜上皮细胞摄取并表达镇痛的生物学作用。

　　【关键词】 镇痛;脑啡肽;绿色荧光蛋白

　　Expressive Locations and Biologic Effects of Plasmid pETFPC3hPPE Injected in the Rats’ Subarachnoid Space

　　TU Xinming,HU Yile,CAO Jing,et al

　　(Medical College,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

　　Abstract:Objective To observe enkephalin’s expressive locations and biologic effects after injecting plasmid pETFPC3hPPE into rat’s subarachnoid space. Methods 30 rats were divided into experiment group, blank plasmid control group and control group, injected plasmid pETFPC3hPPE, plasmid pETFPC3 and sham operation respectively. After 2 days, observe every rat’s algaesthesis temperature sensitive changes. After 8 days, injecting allylnoroxymorphone into rats as well as observing its antagonism against enkephalin and detect green fluorescent protein to determine plasmid’s rhagiocrine cell uptook and expressed locations. Results After operation 4 days, experimental group rats prolong their algaesthesis temperature sensitive reaction time obviously and green fluorescent protein are found in cerebral pia mater, spinal pia mater and spinal nerves respectively. Conclusion Plasmid pETFPC3hPPE can be uptook by rat’s epithelial cell of pia mater and revealed paregoric biologic effects.

　　Key words:analgesia;enkephalin;green fluorescent protein

　　顽固性疼痛的治疗是困扰医疗界的一大难题，它给患者带来巨大的痛苦及经济负担。传统的阿片类药物虽有较好的镇痛效果，但其成瘾性、呼吸抑制等副作用阻碍了其在临床上的应用，以脑啡肽为代表的内源性阿片肽，以镇痛效果好、副作用小等优点引起研究者的广泛关注。本实验将前脑啡肽原基因(PENK)连于pEGFPC3真核绿色荧光载体，注入大鼠蛛网膜下腔，观察新构建的载体在大鼠体内被摄取的部位及其生物学作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　重组质粒pEGFPC3hPPE在前期实验中构建[1]，由郑州大学基础医学院解剖学教研室构建并保存。去除内毒素质粒大提试剂盒购自天根生物公司，成年SD大鼠购自郑州大学动物中心，鼠爪热辐射刺激测痛仪(7371 plantar test)购自UgoBasile。

　　1.2 去内毒素pEGFPC3hPPE质粒的鉴定与制备

　　取保存的重组质粒pEGFPC3hPPE 10 μL加至100 μL感受态细菌中转化，37℃培养过夜后挑颗粒饱满的单菌落培养，小量提取质粒，送上海生工公司测序，鉴定序列正确后参照天根生物公司去内毒素质粒大提试剂盒说明书大量制备pEGFPC3hPPE。取样品在紫外分光光度计上进行OD260和OD280测定，根据核酸浓度=OD260×稀释倍数×50/1 000的计算公式算出所提取质粒DNA溶液的浓度值。

　　1.3 动物试验

　　1.3.1 分组

　　取重量220～250 g雄性SD大鼠30只，随机分成实验、空质粒对照、与假手术对照3组，实验组每只大鼠鞘内注射30 μg重组质粒pEGFPC3hPPE，空质粒组每只大鼠鞘内注射30 μg pEGFPC3，对照组仅作假手术。

　　1.3.2 鞘内给药

　　采用直接注射给药法，将大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，在显微解剖镜下用5号注射器针头腰4、5或腰5、6椎间隙破皮，使用100 μL微量注射器刺入蛛网膜下腔(如见鼠尾甩动证明穿刺成功)，注射完毕后留针2 min。术后密切关注伤口情况，避免炎症的发生。

　　1.3.3 热痛阈测定

　　术前3 d起每天利用鼠爪热辐射刺激测痛仪测定大鼠足底部的热刺激缩足反射潜伏期(图1)，用热刺激缩足反射时间表示热痛阈。

　　1.3.4 拮抗剂实验

　　术后8 d时，3组大鼠分别腹腔注射阿片受体拮抗剂—纳洛酮(0.08 mg/kg)，分别在用药前、用药后10 min、用药后1 h测量大鼠热痛阈的变化，观察对镇痛效果的影响。

　　1.3.5 荧光观察

　　术后10 d时各组取两只大鼠，灌注后取脑膜、脊膜和脊神经直接铺片在荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达。

　　1.4 统计学处理

　　用SPSS for Windows 13.0对数据进行t检验和方差分析，以P<0.05为具有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 各组大鼠热痛阈值变化

　　术前3组大鼠热痛阈值无明显变化(P>0.05), 术后4 d起实验组大鼠热痛阈值明显升高(P<0.01)，空质粒对照、与假手术对照两组则无明显变化，15 d起开始下降，22 d时3组大鼠热痛阈值无明显差别(见图2)。

　　2.2 纳洛酮拮抗效应

　　术后第8天，3组大鼠分别腹腔注射纳络酮(阿片受体拮抗剂)。用药前与用药后10 min实验组大鼠热痛阈值分别为 (24.89±1.73) s、(17.42±1.12) s，有显著差异(P<0.01)，空质粒对照、与假手术对照两组则无明显变化。用药后1 h实验组大鼠热痛阈值恢复至(24.03±1.66) s。

　　2.3 绿色荧光的表达

　　术后10 d，在实验组与空质粒对照组大鼠软脑膜、软脊髓及脊神经外膜上见绿色荧光蛋白的表达(见图3)，而大鼠的心、肝、脾、肺、肾及股四头肌均没有发现绿色荧光。

　　3 讨论

　　对于癌症晚期病人及慢性顽固性疼痛的患者，疼痛给患者带来巨大的痛苦，普通的非甾体、抗惊厥、抗抑郁类镇痛药不能起到有效的镇痛作用，阿片类药物虽有较好的镇痛作用，但其成瘾性、呼吸抑制等副作用也加速了癌症晚期的死亡，而对于慢性顽固性疼痛的患者，由于阿片类药物使不少患者染上了毒瘾，给患者及家庭带来巨大的经济负担，也给社会带来不安定因素。内源性阿片肽[2]是哺乳动物体内天然生成的具有阿片样作用的肽类物质的总称，包括脑啡肽、内吗啡肽、孤啡肽、强啡肽和β内啡肽5大类，其主要作用就是通过与机体内阿片类受体结合参与疼痛信息的调控，抑制痛信息的传递，从而发挥镇痛效应[3]。脑啡肽1975年由Hughes在猪脑中首次发现并分离，他通过作用于神经细胞表面的δ和μ阿片受体而发挥镇痛效应[4]。大鼠脑室内注射微量脑啡肽即可产生明显的镇痛效应且大剂量应用时无明显的呼吸和循环功能障碍，但由于其在体内降解速度快，不能在体内获得持续有效的血药浓度[5]，限制了其在临床上的应用。上世纪80年代伴随分子生物学技术的飞速发展为转基因技术的产生奠定了基础，也为疼痛的转基因治疗开启了新时代[6]。本实验将前脑啡肽原基因绿色荧光真核载体，注入大鼠蛛网膜下腔在软脑膜、软脊髓及脊神经外膜上发现绿色荧光蛋白的表达，而大鼠的心、肝、脾、肺、肾及股四头肌均没有发现绿色荧光。表明鞘内给药后，质粒被大鼠脑与脊髓软膜表面上皮细胞摄取并表达，其他部位没有绿色荧光表明鞘内注射的质粒局限于蛛网膜下腔没有向其他部位扩散，证明基因镇痛中蛛网膜下腔注射是相对安全的。大鼠热敏试验反应时间的延长表明大鼠的热痛阈值提高，纳洛酮的拮抗作用表明其发挥镇痛作用的是这些新合成的脑啡肽，从而证明外源基因介导合成的脑啡肽具有与自身分泌的脑啡肽同样的镇痛生物学功能。

　　【参考文献】

　　[1]李永辉，胡伊乐，涂心明，等.人前脑啡肽原绿色荧光蛋白真核表达载体的构建[J]. 河南科技大学学报(医学版), 2010,28(1):77-79.

　　[2] MartinKleiner I, Gabrilovac J. The κopioid agonist U269593 affects intracellular calcium level in R1. 1 mouse thymoma cell line [J]. Int Immunopharmacol, 2002, 2 (7): 975-980.

　　[3] Pinto M, Castro AR, Tshudy F, et al. Opioids modulate pain facilitation from the dorsal reticular nucleus[J]. Mol Cell Neurosci,2008,39(4):50.

　　[4] Xu W, Sanz A, Pardo L, et al. Activation of the mu opioid receptor involves conformational rearrangements of multiple transmembrane domains[J]. Biochemistry, 2008, 47 (40):10576-10586.

　　[5] 臧卫东. APA微囊化转前脑啡肽原基因细胞移植镇痛的试验研究[D].郑州大学，2006：90-98.

　　[6] 徐颖，田玉科，田学愎，等. 可诱导表达脑腓肽的大鼠星形胶质细胞株的构建[J]. 第四军医大学学报，2006，27(5):400-403.