维、汉两民族脂联素基因+45位点和+349位点SNPs及其与肥胖关系的研究

　　【摘要】 目的探讨维、汉两民族脂联素基因(adipose most abundant gene transcript 1)+45位点及+349位点单核苷酸多态性与肥胖的关系。方法采用优化的特异性引物PCR(SSPPCR)技术确定脂联素基因+45位点和+349位点的基因型。 结果肥胖组与对照组中汉族脂联素基因+45位点GT基因型频率均高于维吾尔族，2组维吾尔族TT基因型频率均高于汉族，但差异无统计学意义(P>0.05);维吾尔族人群肥胖组和对照组的脂联素基因+349位点A、G等位基因频率分布差异具统计学意义(P<0.05)。结论维、汉两民族脂联素基因的+45位点可能存在差异，维吾尔族人群脂联素基因+349位点A、G等位基因频率与肥胖有关。

　　【关键词】 脂联素; 单核苷酸多态性; 肥胖; 序列特异性引物PCR

　　Associations of obesity with single nucleotide polymorphisms of APM1 between Uygur and Han people

　　WANG Yanjiao, JIAO Yi, CHEN Hong, et al

　　(Department of Biochemistry, Preclinical Medicine College, Xinjiang Medical University,Urumqi 830011, China)

　　Abstract: ObjectiveTo study the association of +45 and +349 of APM1 with obesity between Uygur and Han people. MethodsImproved sequencespecificprimers polymerase chain reaction (SSPPCR) were used to show clear， quick and accurate genotype. ResultsThe frequencies of +45 G/T genotype of APM1 of Han people were higher than those of Uygur people in both normal control group and obesity group, and the frequencies of T/T genotype of Uygur people were higher than those of Han people in the both groups， but the difference was not significant. The frequencies of +349 A allele and G allele of APM1 between normal control group and obesity group of Uygur people (P<0.05). ConclusionThe frequencies of genotype of +45 of APM 1 might be different between Uygur and Han people. A allele and G allele of +349 of APM 1 was associated with obesity of Uygur people.

　　Key words: adiponectin gene; single nucleotide polymorphism; obesity; SSPPCR

　　脂肪细胞具有分泌功能，它可分泌多种蛋白如肿瘤坏死因子、瘦素及脂联素等脂肪因子。脂联素基因(APM1)定位于3q27，脂联素基因突变或表达减少可能与2型糖尿病有关[1-4]。正常人脂联素基因序列中存在相当数量的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)，SNP的变化可能直接影响脂联素的血浆水平，与肥胖、2型糖尿病和冠状动脉粥样硬化等疾病的发展和演变有关[5-6]。因此，对脂联素多态性的研究可能为解释肥胖的发生发展机理提供新的思路。本研究旨在探讨维、汉两民族脂联素基因+45位点和+349位点单核苷酸多态性与肥胖的关系，初步研究该基因多态性与肥胖的关系。

　　1　材料和方法

　　1.1　研究对象

　　新疆维吾尔自治区人民医院住院病人，均为胆结石患者。所有研究对象均无亲缘关系，且排除心、肺、肾疾病和糖尿病及其它内分泌疾病患者。根据1999年亚太地区诊断标准，以体质指数(BMI)≥25 kg/m2为肥胖，BMI<25 kg/m2为正常体重。共239名肥胖患者，其中维吾尔族181名，汉族58名;141名非肥胖对照，其中维吾尔族87名，汉族54名。

　　1.2　标本采集

　　抽取受试者空腹静脉血2 ml，EDTA抗凝，-20℃保存。

　　1.3　方法

　　所有研究对象均脱鞋，仅穿贴身衣服，测量身高和体重，计算BMI。酚/氯仿抽提法提取外周血DNA，溶解于40 μl TE溶液，并测定DNA浓度及纯度。根据人脂联素基因序列，运用Primer 5.0设计特异性引物，使引物的3′末端有2个连续的错配碱基，每个SNP位点分别设计2个上游引物和1个下游引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)。PCR 反应体系为20 μl，含2×PCR master(含Mg2+、dNTP、Taq 酶)10 μl，基因组DNA样品50 ng，10 μM的上下游引物各0.5 μl，补足ddH2O至20 μl。 循环参数: 94℃热启动4 min，94℃35 s、55℃35 s、72℃35 s，共35个循环;72℃7 min，1个循环。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。表1人脂联素基因+45位点及+349位点的引物序列(略)

　　1.4　基因分型

　　人APM 1基因第二外显子的+45位点和第二内含子+349位点分别存在T/G和G/A的变换。根据基因序列，设计特异性引物，使引物的3′末端有2个连续的错配碱基，以提高分型结果的可靠性。

　　1.5　统计学处理

　　用SPSS16.0软件完成,经HardyWeinberg平衡检验，确认样本的群体代表性。基因型频率、等位基因频率及组间两者的比较采用卡方检验，检验水准α=0.05。

　　2　结果

　　2.1　基因分型

　　电泳结果利用扩增产物的有/无判断基因型，同一模板的2管PCR产物如果只有1管有扩增产物，则属于野生纯合型或突变纯合型;如果2管都有扩增产物的，则属于杂合型。PCR扩增产物经电泳后，可以非常快捷的对基因进行分型(图1、2)。

　　2.2　脂联素基因+45位点SNPs结果

　　分别对维、汉两民族各组的脂联素基因+45位点的SNPs进行分析，基因型频率、等位基因频率分布差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。表2　两民族肥胖组与对照组脂联素基因+45位点基因型和等位基因频率的比较(略)

　　2.3　脂联素基因+349位点SNPs结果

　　分析人脂联素基因+349位点SNPs发现，维吾尔族肥胖组和对照组脂联素基因+349位点的等位基因频率分布差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。表3　两民族肥胖组与对照组脂联素基因+349位点基因型和等位基因频率的比较(略)

　　2.4　脂联素基因+45位点SNPs结果

　　分别对本研究人群肥胖组、对照组的脂联素基因+45位点的SNPs进行分析，脂联素基因+45位点的肥胖组GG基因型频率在维吾尔族和汉族人群中均有增加趋势，而该组GT基因型频率在两民族人群中均出现下降趋势。基因型频率、等位基因频率分布差异均无统计学意义(P>0.05)，见表4。表4　各组不同民族脂联素基因+45位点基因型和等位基因频率的比较(略)

　　2.5　脂联素基因+349位点SNPs结果

　　分析本研究人群肥胖组、对照组的脂联素基因+349位点SNPs发现，脂联素基因+349位点的肥胖组维吾尔族AA基因型频率高于汉族，对照组的维吾尔族AA基因型频率低于汉族，但差异无统计学意义。基因型频率、等位基因频率分布差异均无统计学意义(P>0.05)，见表5。表5　各组不同民族脂联素基因+349位点基因型和等位基因频率的比较(略)

　　3　讨论

　　人类脂联素基因(APM1)是单拷贝基因，位于染色体3q27,全长约17 kb,包括3个外显子和2个内含子。染色体3q27区域存在2型糖尿病、代谢综合征和肥胖症的易感位点[7]。研究发现，APM1与胰岛素增敏作用有关，也能促进脂肪酸的氧化[8]。而脂联素基因多态性可能会影响该基因的转录或表达，进一步导致脂联素功能的改变而致病，目前对该基因多态性研究最多的是SNPs。Hara等[9]发现，法国白种人和日本人中脂联素基因SNPs发生频率较高的有14个，其中包含外显子2的+45，内含子2的+276、+349和+712以及3’侧翼区的+2019。而Vasseur等[10]对日本人群的筛查结果发现了6个新的SNPs：11156 insCA，11043C>T和外显子3的4个非同义突变(G84R，G90S，R92X，Y111H)，说明脂联素基因的SNPs可能与遗传背景和环境等因素有关。本研究主要探讨维、汉两民族脂联素基因+45位点及+349位点SNPs与肥胖的关系。+45位点的分析结果显示，肥胖组与对照组间基因型频率及等位基因频率分布差异无统计学意义，组间相比GG基因型和GT基因型在维吾尔族人群和汉族人群中都呈现出下降和上升的趋势，但由于本研究样本量较小，因此不能排除这两种基因型与肥胖的相关性。王长江等[11]的研究表明汉族人群脂联素基因+45位点变异与肥胖相关。本研究维吾尔族脂联素基因+349位点A和G等位基因频率在肥胖组和对照组间分布差异有统计学意义，提示这2个等位基因的分布与该民族的肥胖有关，而汉族人群中未发现其与肥胖的相关性，其原因可能是：两民族遗传上的不同导致这种差异出现,也可能是本研究汉族病例偏少致使统计结果的可靠性降低。本研究对同组的不同民族进行对比分析，结果发现，两民族间基因型频率、等位基因频率的分布差异均无统计学意义，但肥胖组中维吾尔族脂联素基因+349位点G等位基因频率低于同组的汉族G等位基因频率，而对照组的该频率维吾尔族高于汉族;同时，A等位基因频率在维吾尔族肥胖组中有升高的趋势而同组的汉族出现下降的趋势，提示脂联素基因SNPs与遗传背景关系密切,也可能因为样本量差异较大无法进行科学的统计分析。总之，APM1基因多态性与肥胖的发生、发展可能存在关系，但需要进一步通过增加样本量加以确定。而该基因的SNPs是肥胖发生过程的偶然事件还是一种标志，先有肥胖后出现SNPs还是先有SNPs才易导致肥胖的发生，尚不清楚，需深入研究。

　　【参考文献】

　　[1]夏晖,莫永珍,卞茸文,等.中国人脂联素基因单核苷酸多态性与2型糖尿病的相关性[J].中华内分泌代谢杂志,2004,20(3):236237.

　　[2]汝颖,马猛,马腾,等.脂联素基因SNP276多态性与2型糖尿病易感性及胰岛素敏感性的关联[J].中华医学遗传学杂志,2005,22(6):698701.

　　[3]Cartegni L, Chew SL, Krainer AR, et al. Listening to silence and understanding nonsense:exonic mutations that affect sp licing[J].Nat Rev Genet,2002,3:285298.

　　[4]徐丽,凌文华.脂联素基因多态性研究进展[J].Section Endocrinol Foreign Med Sci,2005,25:s1s3.

　　[5]Yamauchi T, Kaman J, Minokoshi Y, et al. Adiponectin stimulates glucose utilization and fatty acid oxidation by activating AMPactivated protein kinase[J].Nat Med,2002,8(11):12881295.

　　[6]Maeda N, Shimomura I, Kishida K, et al. Dietinduced insulin resistance in mice lacking adiponectin/ACRP30[J].Nat Med,2002,8(7):731737.

　　[7]Vionnet N, Hani EH, Dupont S, et al. Genome wide search for type 2 diabetes suscep tibility genes in French whites evidence for a novel susceptibility locus for earlyon set diabetes on chromosome 3q27qter and independent replication of a type 2 diabetes locus on chromosome 1q21 q24[J].Am J Hum Genet,2000,67(6):14701480.

　　[8]Wang Y, Xu AM, Knight C, et al. Hydroxylation and glycosylation of the four conserved lysine residues in the collagenous domain of adiponectin[J]. J Biol Chem,2002,277(22):1921.

　　[9]Hara K, Boutin P, Mori Y, et al. Genetic variation in the gene encoding adiponectin is associated with an increased risk of type 2 diabetes in the Japanese population[J]. Diabetes,2002,51:536540.

　　[10]Vasseur F, Helbecque N, Dina C, et al. Single nucleotide polymorphism haplotypes in the both proximal promoter and exon 3 of the APM1 gene modulate adipocytesecreted adiponectin hormone levels and contribute to the genetic risk for type 2 diabetes in French Caucasians[J]. Hum Mol Genet,2002,11:26072614.

　　[11]王长江,王佑民,汝颖,等.脂联素基因第45位点单核苷酸多态性与肥胖及胰岛素抵抗的相关性[J].中华糖尿病杂志,2005,13(5):324325.