没食子鞣质及有效提取物对致龋细菌代谢的影响

　　【摘要】 目的: 研究没食子鞣质及其提取物对致龋菌产酸及产水不溶性胞外多糖能力的影响，探讨实验药物的防龋机制。方法：选择4种与龋病密切相关的口腔细菌作为实验菌株，以没食子鞣质及其提取物2为实验药物，研究对口腔细菌产酸的影响;同时选择主要产糖菌变形链球菌和粘性放线菌为实验菌株，研究实验药物对其合成水不溶性胞外多糖能力的影响。结果：没食子鞣质及其提取物2能有效抑制实验菌株的产酸能力，只是在药物浓度上有一定差异。没食子鞣质及其提取物2对变形链球菌合成水不溶性胞外多糖有明显的抑制作用，在实验浓度下对粘性放线菌合成水不溶性胞外多糖没有明显抑制作用。 结论：没食子鞣质及其提取物对口腔主要致龋细菌的酸代谢和糖代谢都有一定的抑制作用。

　　【关键词】 没食子; 致龋细菌; 产酸; 产糖

　　The effect of Turkish gall on the metabolism of cariogenic bacteria in vitro

　　ZHAO Jin， SUN Yu-liang， NIU Qiao-li， et al

　　(Department of Stomatology, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University,

　　Urumqi 830011, China)

　　Abstract: Objective： The purpose of this study was to investigate the role of Turkish gall extract on the metabolism of glycose metabolism and acid metabolism of cariogenic bacteria and to find out the mechanism of anticariogenic of Turkish gall. Methods： Turkish gall 1，Turkish gall 2 were selected to experiment medicine and there medicines to Streptococcus mutans ATCC25175, Actinomyces naeslundiiWVU627, Actinomyces viscosus ATCC19246 and Lactobacillus rhamnosus AC413 were checked, to observed the change of glycose metabolism and acid metabolism. Results: Turkish gall 1， Turkish gall 2 had an inhibitory effect to the acid of cariogenic bacteria, but the concentration of the two experiment medicine were different. Turkish gall 1 and Turkish gall 2 had an inhibitory effect to the WIG of Streptococcus mutans, but had not an inhibitory effect to the WIG of Actinomyces viscosus. Conclusion: Turkish gall 1 and Turkish gall 2 had an inhibitory effect to the glycol metabolism and acid metabolism.

　　Key words: Turkish gall; caries; acid metabolism; glycose metabolism

　　产酸和产生细胞外多糖是口腔细菌致龋的重要生物学特征。多数口腔细菌可通过代谢碳水化合物产生有机酸，随着菌斑内酸性代谢产物的不断累积，局部pH值逐渐降至临界pH范围，牙体硬组织脱矿，从而形成龋损。合成细胞外多糖的能力与口腔细菌的致龋性密切相关。胞外多糖包括水不溶性多糖(WIG)和水溶性多糖(WSG)，前者能促进细菌的粘附和集聚，参与菌斑基质的组成，促进菌斑形成并作为致龋菌的生物屏障，后者则可作为一种胞外贮能形式，参与菌斑代谢[1-2]。本实验选择4种与龋病密切相关的口腔细菌作为实验菌株，以没食子鞣质及其提取物2为实验药物，研究其对口腔细菌产酸的影响;同时选择主要产糖菌变形链球菌和粘性放线菌为实验菌株，研究实验药物对其合成水不溶性胞外多糖能力的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验菌株 变形链球菌Streptococcus mutans ATCC 25175，内氏放线菌Actinomyces naeslundii WVU 627，粘性放线菌Actinomyces viscosus ATCC 19246，乳酸杆菌Lactobacillus rhamnosus AC 413，实验菌株由口腔生物医学工程教育部重点实验室提供。

　　1.2 菌悬液制备 将复苏48 h后的各株细菌分别接种于BHI液体培养基中，在80% N2、20% CO2、37℃条件下厌氧培养18 ～24 h，涂片检查为纯培养后，使用Crystal SpecTM比浊仪(美国 Becton Dickinson and Company)测取菌悬液浓度，用BHI将菌悬液浓度调至1.0 McFarland(3×108 CFU/ml)备用。

　　1.3 没食子鞣质及其提取物2对口腔致龋细菌产酸水平影响的测定 根据实验药物对4种口腔细菌的MIC测定结果，选取MIC值以下的4个浓度梯度配制成BHI液体培养基，调定初始pH值为7.4，各组按体积比10∶1接种等量菌悬液，80% N2、20% CO2下厌氧培养48 h。以ORION 710A型 pH计测定培养物上清液的pH值，并计算pH变化值(ΔpH)(初始pH -终末pH)。以不含药物的培养基中pH值的变化作为空白对照。实验共分5组，即4个不同浓度的实验组与1个空白对照组，每组4个平行管。

　　1.4 没食子鞣质及其提取物2对口腔致龋细菌合成胞外多糖的影响 选择变形链球菌和粘性放线菌为实验菌株，研究没食子鞣质及其提取物2对其合成胞外多糖的影响。根据实验药物对不同口腔细菌的MIC测定结果，选取MIC值以下4个浓度梯度配制成BHI液体培养基。按菌液与BHI液体培养基1∶10(v/v)的比例分别接种变形链球菌 S. mutans ATCC 25175和粘性放线菌 A.viscosus ATCC 19246，在80% N2、20% CO2、37℃条件下厌氧培养24 h，培养液以6 000 r/min离心25 min，沉淀物用5 ml蒸馏水洗涤、离心2次，水洗后的沉淀物加入0.4 M NaOH 5 ml洗涤、离心3次，合并上清液作为样品。取适量上清液，以蒽酮法测定水不溶性葡聚糖含量。

　　1.5 实验分组 阳性对照组：含菌悬液的BHI液体培养基，每组4个平行;阴性对照组：含0.05%洗必泰的BHI菌悬液培养基，每组4个平行;实验组：含五倍子和蜂房有效成分的BHI菌悬液培养基，每组4个平行。

　　1.6 统计学分析 数据采用SPSS 10.0 统计软件分析，选用单因素方差分析的Dunnet t双侧检验，检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 没食子鞣质及其提取物2对口腔致龋细菌产酸的抑制作用 没食子鞣质及其提取物2能有效抑制实验菌株的产酸能力，只是在药物浓度上有一定差异(表1)。 表1 没食子鞣质及其提取物2对口腔致龋细菌产酸的抑制作用注: 与对照组相比， *P<0.052.2 没食子鞣质及其提取物2对口腔致龋细菌合成胞外多糖的影响 低浓度没食子鞣质对变形链球菌合成水不溶性胞外多糖有明显的抑制作用，而在较高的实验浓度下没食子提取物2才会对变形链球菌合成水不溶性胞外多糖有抑制作用，但是在实验浓度下对粘性放线菌合成水不溶性胞外多糖没有抑制作用(表2)。表2 没食子鞣质和提取物2对变形链球菌和粘性放线菌产胞外多糖的影响注: 与对照组相比， *P<0.05

　　3 讨论

　　自从1944年Stephan curve被发现以来，龋病研究者的目光就集中在细菌产酸方面的研究上。产酸和产生胞外多糖是口腔细菌致龋的重要生物学特征。致龋菌通过无氧酵解代谢碳水化合物产生有机酸，在牙菌斑生物膜中使酸性代谢产物积聚，导致牙菌斑生物膜-牙体硬组织界面pH值下降，达到临界pH(5.4～5.5),釉质脱矿，龋损发生。因此细菌产酸和耐酸的能力长期以来被认为是致龋菌最重要的毒力因子之一。本研究通过产酸抑制实验考察了没食子鞣质及其提取物2对口腔细菌产酸能力的影响，发现没食子鞣质及其提取物2 在MIC浓度以下即能够有效抑制4种与龋病相关细菌的产酸能力。没食子鞣质对细菌的抑制作用可能来自于其与蛋白质结合的特性，而没食子提取物2的主要成分没食子酸和没食子酸甲酯并没有沉淀蛋白质的作用，其对变形链球菌的产酸抑制作用的机制还需进一步探讨。

　　细菌合成细胞外多糖的能力与菌斑的形成及其致龋性有密切的关系。细胞外多糖，特别是水不溶性胞外多糖参与菌斑基质的组成，促进细菌的黏附、聚集，加速菌斑的形成。水不溶性胞外多糖还具有生物屏障作用，使菌斑内外各种物质的出入受到限制;使菌斑内细菌代谢产物如有机酸等不易扩散，造成釉质表面局部pH值下降。它可作为储能形式，在外源性糖缺乏时，降解成单糖而放能、产酸。许多口腔细菌均能产生葡糖基转移酶，以糖，尤其是蔗糖为底物，合成以α-1,3糖苷键为主的葡聚糖。本实验结果表明没食子鞣质对变形链球菌合成水不溶性胞外多糖有明显的抑制作用，而在实验浓度下对粘性放线菌合成水不溶性胞外多糖没有明显抑制作用。没食子鞣质具有强烈的抑制变形链球菌葡糖基转移酶的作用[3]，其中具有5～6个倍酰基的penta galloyl glucose(黄倍酰单宁)和hexagalloyl glucose，在1 mMol浓度即显示出了近100%的抑制活性，甚至强于洗必泰。对植物多酚的研究也证实，随着聚合程度的增加，乌龙茶中多酚类物质对变形链球菌的葡糖基转移酶的抑制活性增加[4]。本实验分离得到的提取物2的主要成分为没食子酸和没食子酸甲酯，没有观察到对变形链球菌产生水不溶性多糖的明显抑制作用。Wu-Yuan等[5]研究也发现0.25 mg/ml的没食子酸及没食子酸甲酯对变性链球菌依赖gtf 产生的水不溶性胞外多糖几乎没有抑制作用。因此，可以推测五倍子多酚性化合物中抑制变形链球菌产生水不溶性多糖的成分不是没食子酸和没食子酸甲酯，可能是其它化学组分。

　　在对口腔细菌产酸与合成胞外多糖影响的实验中，为了排除药物本身因抑制菌细胞生长而产生的对产酸与产糖代谢的抑制表现，采用了在MIC浓度以下的4个浓度梯度，即在未对细菌细胞生长发生明显抑制时观察其抑制细菌产酸与产糖代谢的情况。

　　【参考文献】

　　[1] 黄晓晶，刘天佳，杨锦波, 等. 高龋及无龋患者变形链球菌(血清型C)临床分离株体外致龋性能研究：合成细胞外多糖能力的实验研究[J]. 华西口腔医学杂志，2000, 18(6)：419-421.

　　[2] 刘天佳. 口腔疾病的微生物学基础[M]. 北京: 人民卫生出版社，1999：43-65.

　　[3] 李 彩,郝玉庆,周学东. 我国天然药物防龋的研究进展[J]. 实用医院临床杂志, 2007, 4(2)：4-6.

　　[4] Sasaki H, matsumot M, Tamaka T, et al. Antibacterial activity of polyphenol components in onlong tea extract against Streptococcus mutans[J]. Caries Research, 2004, 38:2-8.

　　[5] Wu-Yuan CD, Chen CY, Wu RT, et al. Gallotannins inhibit growth, water-insoluble glucan synthesis, and aggregation of mutans streptococci [J]. Dent Res, 1988, 67:51-55.