血府逐瘀汤对兔椎间盘退变模型软骨组织中TNFα的影响

　　【摘要】 目的：观察肿瘤坏死因子(TNFα)在椎间盘退变中的作用和血府逐瘀汤对其的影响。方法：①取10只6月龄日本长耳白兔，随机分手术造模组与假手术组，每组5只，术后8周证实造模成功后分别处死取软骨终板，用Elisa法测TNFα含量变化。②取20只6个月龄日本长耳白兔按上述手术造模组方法造模，造模成功后随机分为生理盐水组和血府逐瘀汤组，每组10只，予相应药物治疗。治疗后第1、2个月分别用Elisa法测软骨终板TNFα含量变化。结果：①手术造模组较假手术组椎间盘软骨中TNFα明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。②治疗1个月后血府逐瘀汤组与生理盐水组比较，椎间盘软骨中TNFα降低明显，差异有统计学意义(P<0.05);治疗2个月后血府逐瘀汤组较生理盐水组比较，椎间盘软骨中TNFα明显降低，差异有统计学意义(P<0.05);手术造模组与生理盐水组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论：血府逐瘀汤能降低退变椎间盘软骨组织中TNFα水平，起到抑制或延缓椎间盘退变的作用

　　【关键词】 兔 椎间盘退变 血府逐瘀汤 肿瘤坏死因子α

　　Experimental study on the effect of Xuefuzhuyutang on TNFα in the cartilage tissue of disc degeneration of rabbits HUANG Xiaotao,MA Zhenchuan,LV Cunxian,et al.Zhejiang Traditional Chinese Medicine,Hangzhou(310053),China

　　Abstract Objective:To observe the changes of tumor necrosis factor alpha(TNFα) in the disc degeneration and normal tissues and to study the impact of Xuefuzhuyutang on TNFα in the cartilage tissue of disc degeneation.Methods:i.Ten 6monthold Japanese white rabbits were randomly divided into operation model group and sham operation group,5 in each and were executed in 8 weeks after operation when successful modeling was proved.Cartilage endplate was taken out to measure TNFα content with the ELISA method.ii.Another 20 6monthold Japanese white rabbits followed the abovementioned operation of the operation model group randomly divided into normal saline group and Xuefuzhuyutang group when successful modeling was proved,10 in each.The content of TNFα was determined in 1 and 2 months after treatment with the same method.Results:i.The content of TNFα in the operation model group was higher than that in the sham operation group,with a statistically significant difference(P<0.05).ii.The content of TNFα was gradually decreased in the Xuefuzhuyutang group;both the levels in 1 and 2 months after treatment were lower that those in the normal saline group (P<0.05);no significant difference was noted between the operation model group and the normal saline group (P>0.05).Conclusion:Xuefuzhuyutang may suppress or delay intervertebral disc degeneration by downregulating the content of TNFα in cartilage endplate tissues of the degenerated lumbar disc.

　　Key words Rabbit disc degeneration Xuefuzhuyutang tumor necrosis factor alpha

　　目前认为，某些细胞因子如TNFα可通过诱导炎性介质的释放和细胞凋亡，促进腰椎间盘退变。笔者通过诱导腰椎间盘退变，建立兔腰椎间盘退行性变模型，检测其中TNFα水平，并应用血府逐瘀汤治疗后观察其TNFα水平变化，报道如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物分组 6月龄日本长耳大白兔30只，雌雄不限，体重2.0～2.5kg，由浙江中医药大学动物实验中心提供。先将10只兔子按随机数字表法随机分为手术造模组与假手术组，每组5只。待证实造模成功后，再将剩余20只按手术造模组方法处理后随机分为生理盐水组与血府逐瘀汤组，每组10只。

　　1.2 造模方法 除假手术组外，将兔背部退毛及清洁后，按1ml/kg体重行耳缘静脉注射3%戊巴比妥麻醉，沿腰3～腰6棘突做正中切口，贴棘突两侧切断骼棘肌附着，并在棘突处行骨膜下剥离，显露棘突、椎板和关节突，切除腰3～6棘突、棘上和棘间韧带及两侧关节突关节外1/2，切除后沿原路逐次缝合。术后1周，创口愈合后，每只兔子背部压1/10体重的物体，每天2小时，并促使其站立饮食和追逐其跑动，以促进造模。假手术组则按上述方法麻醉，做皮肤切口后直接缝合。

　　1.3 药物及用法 血府逐瘀汤组方：桃仁12g,红花、当归、生地各9g，川芎5g，赤芍6g，牛膝9g，枳壳6g，柴胡3g，桔梗5g，甘草3g。水煎浓缩制成1g/mL汤剂。造模后8周血府逐瘀汤组予血府逐瘀汤11.4g/kg灌胃，生理盐水组按等量生理盐水灌胃，均1天1次，连续灌2个月。

　　1.4 TNFα检测 TNFα检测试剂盒由上海灵谷实业有限公司提供，采用夹心法酶联免疫吸附测定(Elisa)。操作步骤：①将软骨标本取出后，立即用-80℃液氮处理1min，待其僵硬变脆，用碾钵碾成粉末。②在粉末组织中以每100mg/2mL加入磷酸盐缓冲液(PBS)，并将匀浆器置予冰水中以2000r/min匀浆2min。再将匀浆物以3000r/min离心5min后，取0.8mL上清液分装于EP管中待测。③试剂盒准备好后将其及待测标本放置室温平衡(18～28℃)，并确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目。④标准品各100μL依次加入一排孔中，将EP管中的标本按100μL每孔加入，并做好标记。⑤标准品孔及待测样本孔中分别加入50μL酶联亲和物，充分混匀。⑥37℃温育60min后充分弃尽各孔内液体，PBS重复冲洗5次并扣干孔内剩余水分。⑦依照次序，每孔分别加入显色液A、显色液B各50μL，混匀，室温下避光反应15min。⑧反应过后，每孔加入终止液50μL，混匀，终止反应。⑨用酶标仪在450nm测定OD值，并在标准曲线上查出相应样品的含量。

　　1.5 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件，数据采用(±s)表示，两样本均数比较应用t检验，多组样本均数比较用精确方差分析。

　　2 实验结果

　　手术造模组TNFα为(62.07±5.94)pg/mL，假手术组TNFα为(15.46±1.62)pg/mL，两组比较差异有统计学意义，P<0.05。已造模成功后生理盐水组与血府逐瘀汤组予各自相应药物治疗2个月，血府逐瘀汤组TNFα检测值明显低于生理盐水组P<0.05，见表1。表1 两组TNFα检测值比较与生理盐水组比较，△P<0.05

　　3 讨 论

　　TNFα是促进和加速炎性介质释放的重要炎性细胞因子，趋化中性粒细胞和单核细胞炎性浸润。TNFα在椎间盘退变过程中能诱发炎性反应，影响金属蛋白酶基质(MMP)的表达和增加前列腺素G2的表达，促进和诱导其退变，且能诱导痛觉和神经根损害，导致神经髓鞘损伤，血管通透性增加。Weiler[1]等通过实验在人椎间盘横截面的中环部发现了TNFα的合成，且随着其表达的增多椎间盘症状加重，推测TNFα的表达与加重椎间盘退变有密切关系。Olmarker[2]等发现通过抑制TNFα的表达不仅能阻止血栓形成，还能防止神经内水肿和减慢神经传导速度。

　　血府逐瘀汤出自清·王清任《医林改错》，原方主治胸中之瘀血，后临床逐渐用于骨科疾病。研究表明，血府逐瘀汤能抑制机体中血栓烷A(TXA2)，升高前列环素(PGI2)水平，从而使TXA2/PGI2比值显著降低，抑制血小板凝聚，改善血液流变性[3]。血府逐瘀汤还能通过抑制机体TNFα而抑制炎性介质释放[4]，提高细胞免疫功能，升高血清SOD浓度，降低丙二醛(MDA)含量，提高机体耐缺氧能力，改善氧自由基代谢紊乱。研究还发现，血府逐瘀汤能抑制细胞凋亡基因caspase3的表达，抑制Bax表达，使Bcl2表达明显增多[5，6]。本实验表明，血府逐瘀汤可下调椎间盘软骨组织中TNFα水平，进而可以延缓和抑制椎间盘退变。

　　【参考文献】

　　[1] Weiler C,Nerlich AG,Bachmeier BE,et al.Expression and distribution of tumor necrosis factor alpha in human lumbar intervertebral discs: a study in surgical specimen and autopsy controls[J].Spine,2005,30:4453.

　　[2] Olmarker K,Rydevik B.Selective inhibition of tumor necrosis factoralpha prevents nucleus pulposusinduced thrombus formation,intraneural edema,and reduction of nerve conduction velocity:possible implications for future pharmacologic treatment strategies of sciatica[J].Spine,2001,26:863869.

　　[3] 王玉香，秦荣，李丹 血府逐瘀汤的现代应用和实验研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2007,9(6)：4950.

　　[4] 洪阳春 血府逐瘀汤对气血两伤型肺挫伤的临床研究[D].广州中医药大学硕士学位论文，2007：3.

　　[5] 林源，梁清华，包太成 血府逐瘀汤对实验性脑出血大鼠活化Caspase3表达的影响[J].实用预防医学，2006，13(5)：11061108.

　　[6] 王大安，蔺志华 血府逐瘀汤干预急性心肌缺血心肌细胞凋亡与Bcl2、Bax表达的实验研究[J].中西医结合心脑血管疾病杂志，2009,7(1)：44.