1-(5′-溴阿魏酰基)-4-苄基哌嗪盐酸盐类似物体外清除羟自由基活性研究

　　【摘要】 目的：研究1-(5′-溴阿魏酰基)-4-苄基哌嗪盐酸盐类似物(BFP，L1～9)在体外清除羟自由基(·OH)的活性。方法：采用邻二氮菲-Fe2+氧化法测定BFP、阿魏酸(FA)、抗坏血酸(Vc)在体外对Fenton反应产生·OH的清除能力，计算表观清除率(CL)。结果：L5的最大·OH表观清除率(CLmax)最大，L8最小，L1、L3、L5、L7的CLmax都比FA、Vc大。结论：BFP苄基苯环上2-Cl、3-Cl、2-CH3、4-CH3、3-OCH3取代，可增强体外清除·OH活性;3-CH3取代，体外清除·OH活性基本不变;2-OCH3、4-OCH3取代，体外清除·OH活性降低。

　　【关键词】 阿魏酸;羟自由基;Fenton反应

　　Study on Hydroxyl Radical Scavenging Activities in vitro of 1-(5′-Bromo Feruloyl)-4-Benzyl Piperazine Hydrochloride Analogs

　　LIN Ai-bin, ZHANG Lu-mian, HE Xiao-ying, ZHENG Jin-hong

　　(Department of Chemistry, Shantou University Medical College, Shantou 515041, China)

　　[Abstract]Objective: To study hydroxyl radical(·OH)scavenging activities in vitro of 1-(5′-bromo feruloyl)-4-benzyl piperazine hydrochloride analogs(BFP，L1～9). Methods: The ·OH scavenging activities in vitro of BFP, ferulic acid(FA)and L-ascorbic acid(Vc)were analysed through 1, 10-phenanthroline-Fe2+ detection system. The ·OH clearance percentage(CL)was calculated. Results: L5 had the highest ·OH maximum clearance percentage(CLmax). L8 had the lowest CLmax. L1, L3, L5 and L7 had higher CLmax than FA and Vc. Conclusion: Substitutes on benzal benzene ring of BFP have different effects on ·OH scavenging activity in vitro. 2-Cl,3-Cl,2-CH3,4-CH3 and 3-OCH3 may enhance the activity. 3-CH3 may not change the activity. 2-OCH3 and 4-OCH3 may reduce the activity.

　　[Key Words]ferulic acid;hydroxyl radical;Fenton reaction

　　阿魏酸(FA)属于酚类抗氧化剂，是当归、川芎、升麻、木贼等中药的活性成分[1]，也可从米糠、小麦、甘蔗、玉米、甜菜[2]等谷物提取获得。FA衍生物具有抗炎、抗脂质过氧化、清除羟自由基(·OH)、抗肿瘤、降血糖、调节DNA损伤[3,4]等药理作用。·OH是活性氧自由基中最活泼、毒性最强的一种，可直接导致DNA 等生物大分子的破坏而引发一系列疾病。细胞在有氧代谢过程中，可通过多种途径产生·OH，机体清除·OH的活性物质不足将导致·OH堆积而引发疾病，所以，研究·OH清除剂具有重要意义。本实验通过测定已合成的FA新衍生物在体外清除·OH的活性，筛选出体外清除·OH活性较强的药物，以便进一步进行抗炎或抗氧化动物模型药理研究。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器与试剂

　　Thermo Labsystems Multiskan Spectrum酶标仪(Labsystems公司，芬兰);1-(5′-溴阿魏酰基)-4-苄基哌嗪盐酸盐类似物(BFP，L1～9，汕头大学医学院化学教研室合成，通过MS、1HNMR、IR结构鉴定，图1，表1);抗坏血酸(Vc，上海国药集团化学试剂有限公司，中国);七水合硫酸亚铁(广州化学试剂厂，中国);体积分数30%的H2O2(上海凌峰化学试剂厂，中国);其它试剂均为国产分析纯。表1 BFP的物理性质(略)

　　1.2 BFP体外清除·OH活性研究

　　采用邻二氮菲-Fe2+氧化法测定BFP、FA、Vc在体外对·OH的清除能力，实验原理：Fenton反应产生的·OH将邻二氮菲-Fe2+氧化为邻二氮菲-Fe3+，使邻二氮菲-Fe2+在536nm的吸光度(A)降低，体系中先加入·OH清除剂，A降低幅度变小，从而通过计算表观清除率(CL)表达药物清除·OH的能力[5,6]。FA、Vc作为阳性对照。BFP、FA、Vc分别采用体积分数60%的乙醇、乙醇、水作为溶剂。各药设6个浓度，按表2的顺序与体积加样于1.5mL EP管中，全部试剂加完后离心6s，(37±1)℃水浴1h，吸取250μL反应终液，加至96孔板中，酶标仪上测定536nm吸光度。表2 测定清除·OH活性操作步骤(略)

　　按下式计算CL：

　　CL=(A药物-A药物参比)-(A损伤-A空白)A未损-A损伤×100%

　　1.3 统计学处理

　　统计分析采用SPSS 16.0软件,用SNK检验比较各药物最大·OH表观清除率(CLmax)间的差异，检验水准а=0.05。

　　2 结果

　　BFP、FA、Vc的CL随浓度变化的关系见表3;各药物CLmax的SNK检验数据见表4。L5的CLmax最大，L8最小，L1、L3、L5、L7的CLmax都比FA、Vc大。表3 BFP体外清除·OH活性CL数据(略)表4 BFP CLmax的SNK检验(略)

　　3 讨论

　　有报道，温度对Fenton反应影响较大[7]，故应保持一致的加样间隔时间，水浴1h要严格计时，设计药物参比组的作用是消除药物溶剂及颜色对测定结果的影响。

　　以L4(R=H)为参照物，BFP体外清除·OH活性的构效关系可归纳为：苄基苯环上2-Cl、3-Cl、2-CH3、4-CH3、3-OCH3取代，可增强体外清除·OH活性;3-CH3取代，体外清除·OH活性基本不变;2-OCH3、4-OCH3取代，体外清除·OH活性降低。从苄基苯环上取代位置分析，2、4位取代既可增强也可降低体外清除·OH活性，3位取代体外清除·OH活性增强或不变。从取代基的电子效应分析，-CH3作为弱供电子基，引入苄基苯环后，目标化合物活性增强或不变;-Cl具有吸电子诱导效应和供电子p-π共轭效应，引入苄基苯环后，活性上升;-OCH3同样具有吸电子诱导效应及供电子共轭效应，引入苄基苯环后，能增加苄基的次甲基电荷密度的2或4位-OCH3，降低了清除·OH活性，而减少苄基的次甲基电荷密度的3位-OCH3，增加了清除·OH活性。2-Cl、3-Cl、2-CH3、4-CH3、3-OCH3取代物可进一步进行抗炎或抗氧化动物模型药理研究。

　　【参考文献】

　　[1]Lu GH, Chan K, Leung K, et al. Assay of free ferulic acid and total ferulic acid for quality assessment of Angelica sinensis[J]. J Chromatogr A, 2005, 1 068: 209-219.

　　[2]Ou S, Luo Y, Xue F, et al. Seperation and purification of fe-rulic acid in alkaline hydrolysate from sugarcane bagasse by activated charcoal adsorption/anion macroporous resin exchange chromatography[J]. J Food Engin, 2007, 78(4): 1 298-1 304.

　　[3]Hazeldine ST, Polin L, Kushner J, et al. Synthesis and biological evaluation of some analogs of the antitumor agents, 2-{4-[(7-chloro-2-quinoxalinyl)-oxy]phenoxy}propionic acid, and 2-{4-[(7-bromo-2-quinolinyl)-oxy]phenoxy}propionic acid[J]. Bioorg Med Chem, 2005, 13: 1 069-1 081.

　　[4]Sudheer AR, Muthukumaran S, Kalpana C, et al. Protective effect of ferulic acid on nicotine-induced DNA damage and cellular changes in cultured rat peripheral blood lymphocytes:A comparison with N-acetyl-cysteine[J]. Toxicology in Vitro, 2007, 21(4): 576-585.

　　[5]Wu WM, Long Y, Wang T, et al. Free radical scavenging and antioxidative activities of caffeic acid phenethyl ester(CAPE)and its related compounds in solution and membranes: A structure-activity insight[J]. Food Chem, 2007, 105: 107-115.

　　[6]Zhao G, Xiang Z, Ye T, et al. Antioxidant activities of Salvia miltiorrhiza and Panax notoginseng[J]. Food Chem, 2006, 99: 767-774.

　　[7]Lee C, Yoon J. Temperature dependence of hydroxyl radical formation in the hv/Fe3+/H2O2 and Fe2+/H2O2 systems[J].