还原型谷胱甘肽对毒鼠强中毒大鼠脑组织γ-氨基丁酸表达的影响

　　【摘要】 目的：探讨还原型谷胱甘肽(GSH)对毒鼠强(TET)中毒大鼠γ氨基丁酸(GABA)表达的影响。方法：30只健康SD大鼠随机分为假手术组、对照组、GSH预处理组，毒鼠强灌胃制备染毒模型，观察各组大鼠脑组织变化情况，并检测脑组织中GABA表达水平。结果：GSH组大鼠惊厥潜伏期延长、中毒症状缓解、大鼠病死率降低，脑组织GABA水平增加。结论：GSH对TET中毒大鼠脑组织有保护作用。

　　【关键词】 还原型谷胱甘肽;毒鼠强;中毒;γ氨基丁酸

　　Effects of Reduced Glutathione on γaminobutyric Acid Expression in Acute Tetramine Poisoning Rats ZHANG Youen1,LI Xiaoquan1,TIAN Lin2,LIU Yong1,WANG Jianing3,FU Shouzhi1* (1Department of Emergency;2Department of Pathology;3Institute of Clinical Medicine,Renmin Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

　　Abstract: Objective To investigate the effect of reduced glutathione(GSH) on the expression of γaminobutyric acid(GABA) in acute tetramine(TET) poisoning rats.Methods Thirty healthy rats were randomly divided into shamoperation group,control group and GSHpretreated group.The acute toxicity animal model was prepared with TET intragastric administration.The changes of pathology in brain tissue were estimated with HE staining.The expressions of GABA in brain were analyzed with immunofluorescecnce method.Results The latency was prolonged,the symptoms were relieved,the mortality was decreased and the expression of GABA was increased in rats of GSH group.Conclusion GSH could effectively protect the brain tissue of acute tetramine poisoning rats.

　　Key words:Reduced Glutathione;Tetramine;Poisoning;γaminobutyric acid

　　毒鼠强(tetramine, TET)是一种结构特殊、性质稳定、毒性极强、不易灭活或分解的神经性杀鼠剂，多认为其是中枢神经系统抑制性神经递质γ氨基丁酸(γaminobutyric acid,GABA)受体非竞争性拮抗剂，通过封闭GABA受体，抑制GABA功能从而出现惊厥症状[1]。还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)是一种自由基清除剂，已被广泛应用于临床急慢性肝肾损伤、心血管疾病及肿瘤的放化疗等[2]。本研究通过观察GSH对TET染毒大鼠脑组织的病理变化和脑组织中GABA表达的影响，以探讨其对毒鼠强中毒是否具有保护作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　毒鼠强由湖北省十堰市公安局提供(纯度98%)，经二甲亚砜(Sigma公司)稀释成浓度为0.0025%溶液。GSH 粉针剂(0.6 g/支，重庆药友制药有限责任公司，批号0807110)。兔抗GABA多克隆抗体(武汉博士德公司)，异硫氰酸荧光素(fluoresein isothiocyanate，FITC)标记的山羊抗兔二抗(美国KPL公司),4，6二氨基2苯基吲哚(4,6Diamidino2phenylinole,DAPI,美国Sigma公司)。

　　1.2 实验动物及分组

　　健康SD大鼠30只(湖北省实验动物中心提供)，雌雄各半，体质量250～300 g，适应性饲养5 d后随机分为假手术组、对照组和GSH预处理组(各10只)。假手术组大鼠腹腔注射等量生理盐水30 min 后以8 mL/kg生理盐水灌胃;对照组腹腔注射等量生理盐水30 min后，以8 mL/kg(0.2mg/kg)毒鼠强悬浊液灌胃;GSH预处理组大鼠腹腔注射GSH(1 g/kg)30 min后，以8 mL/kg (0.2 mg/kg)毒鼠强悬浊液灌胃。

　　1.3 HE染色

　　对毒鼠强灌胃染毒后2 h内死亡的大鼠，立即取脑组织。染毒后2 h内未死亡的大鼠在2 h时间点经10%水合氯醛 250～300 mg/kg 腹腔注射麻醉，开胸，行心脏穿刺，用150 mL 37 ℃生理盐水经升主动脉快速冲洗，再用4℃ 4%多聚甲醛400 mL灌注固定，开颅取脑，切取部分组织行冰冻切片，常规HE染色，光镜观察。

　　1.4 免疫荧光法检测GABA

　　脑组织冰冻切片，PBS漂洗10 min×3，加兔抗GABA多克隆抗体(1∶200)，4℃孵育过夜，PBS漂洗10 min×3，加FITC标记的山羊抗兔抗体(1∶200)，室温孵育2 h，PBS漂洗10 min×3，加DAPI湿盒染色15 min，PBS漂洗5 min×3，抗荧光淬灭封片液封片后于倒置荧光显微镜下观察。每张切片随机选取5个视野，采用Image Pro软件分析，并计算GABA阳性细胞率(绿色荧光标记的阳性细胞数/蓝色荧光标记的细胞总数)。

　　1.5 统计学分析

　　用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料以( x±s)表示，采用χ2检验、方差分析，组间两两比较采用q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 行为学观察

　　对照组大鼠染毒后约5～18 min开始出现躁狂、全身抖动、四肢抽搐、头尾竖起、四肢强直痉挛等中枢神经系统兴奋症状，反复发作数次后，6例因强直性惊厥致呼吸循环衰竭死亡。GSH预处理大鼠20～35 min出现上述症状，程度减轻，2例死亡。假手术组大鼠无上述症状及死亡。

　　2.2 HE染色

　　假手术组脑组织神经元、胶质纤维结构正常;对照组神经元及胶质细胞变性、坏死，胞核溶解，小胶质细胞和中性粒细胞呈点状、灶状聚集;GSH预处理组胶质细胞增生，神经元颗粒变性，胞核疏松，无明显小胶质细胞和中性粒细胞浸润(图1)。

　　2.3 GABA免疫组织化学染色

　　GABA阳性物呈绿色颗粒，主要位于细胞胞膜及胞浆，神经元轴突也有表达。假手术组大鼠脑组织内GABA阳性物分布较为广泛，皮质层、海马以及丘脑均有中等强度的阳性表达(62%)。表达GABA的细胞主要是神经元，部分胶质细胞亦呈阳性。TET组阳性表达较假手术组明显减少(38% vs 62%，P<0.01)，GSH预处理组GABA表达明显增多(54%vs 38%，P<0.01),见图2。

　　3 讨论

　　毒鼠强是一种强烈中枢神经系统兴奋剂，尤其兴奋脑干，具强烈致惊厥效应。可经口腔和胃肠道黏膜吸收，吸收速率较快，通常毒鼠强灌胃染毒l h后，毒素90%以上可吸收进入体内[3]。急性毒鼠强中毒治疗目前尚缺乏明确的特效解毒剂，治疗原则是清除毒物、对症处理及综合治疗[4]。

　　GSH是含有疏基(SH)的三肽结构，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，它参与体内三羧酸循环及糖代谢，并能激活多种酶，从而促进糖、脂肪和蛋白质代谢而影响细胞代谢过程，是细胞内重要的调节代谢物质。它可直接清除自由基，或减少自由基生成，以调节离子分布，抑制细胞因子合成，减少效应细胞活化，减轻靶细胞损伤，调节凋亡相关基因的平衡。对维持细胞的正常代谢，保护细胞膜的完整性具有重要的生化功能。毒鼠强中毒机理可能与阻断GABA受体、拮抗GABA发挥功能有关。

　　由于毒鼠强极性很小，不溶于水，考虑到灌胃时药物应分散于给药介质中，参考表面活性剂在混悬液制备应用方面的资料，本研究选择了用二甲亚砜将毒鼠强制成混悬液后予以灌胃，选择剂量为0.2 mg/kg，以保证染毒后药物可分布于动物体内，染毒后2 h处死观察脑损伤及检测GABA含量，可更好评价GSH效果。

　　本研究结果表明鼠强可对染毒大鼠脑造成损伤，GSH处理可增加GABA含量，减轻染毒大鼠抽搐发作，推测其机制可能为GSH通过抗氧化、清除氧自由基而对细胞产生保护作用[5]。

　　【参考文献】

　　[1]Blair RE,Sombati S,Lawrence DC,et al.Epileptogenesis causes acute and chronic increases in GABA:A receptor endocytosis that contributes to the induction and maintenance of seizures in the hippocampal culture model of acquired epilepsy[J].J Pharmacol Exp Ther,2004,310(3):871-880.

　　[2]李斌晨,吴明营,蒙 革,等.还原型谷胱甘肽临床研究及应用进展[J].中国医疗前沿,2008,3(6):9-10.

　　[3]张宏顺,周 静,张寿林,等.毒鼠强在家兔体内的代谢动力学研究[J].中华预防医学杂志,2005,39(2):91-94.

　　[4]温宇英,韩继媛.毒鼠强中毒的治疗方法研究[J].中国急救医学,2007,27(1):59-61.

　　[5] 陆小香,张蕴琨,江 年.力竭运动后大鼠海马CA1区自由基、下丘脑GABA及HPA轴的动态变化[J].中国运动医学杂志,2007,26(5):563-567