地塞米松对大鼠肺缺血再灌注后eNOS表达的影响

　　作者：许文景 倪松石 ，黄冬云 作者单位：(1江苏省苏北人民医院呼吸内科，扬州225001;2南通大学附属医院呼吸内科;3苏北人民医院老年科)

　　【摘要】 目的：通过观察地塞米松对大鼠肺缺血再灌注后内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的影响探讨其对缺血再灌注肺的保护机制。方法：40只健康SD大鼠，雌雄不拘，随机分为5组：假手术组(S)、单纯缺血组(I)、缺血再灌注组(IR)、小剂量地塞米松干预组(D1)及大剂量地塞米松干预组(D2)，每组8只。根据Eppinger模型制作SD 大鼠单侧肺IRI 动物模型，Western-blot法检测eNOS蛋白质浓度，HE染色观察组织病理学改变。结果：与其它组比较，IR组肺组织中eNOS表达明显下降(P<0.01)，地塞米松干预后，eNOS表达明显增高，以D2组明显。病理切片示IR组肺组织结构损害分级显著重于其它组，地塞米松干预后肺组织结构损害分级下降，以D2组明显。结论：eNOS在正常肺组织中表达较多，IR可使eNOS表达明显下降，地塞米松可使eNOS表达增高，尤以大剂量时明显，地塞米松通过上调eNOS表达减轻缺血再灌注肺组织损伤。

　　【关键词】 缺血再灌注;肺;地塞米松;内皮型一氧化氮合酶;大鼠

　　The effect of dexamethasone on the change of eNOS in the case of ischemia-reperfusion

　　induced pulmonary injury in rat

　　XU Wenjing1，NI Songshi2，HUANG Dongyun3 (1Department of Respiratory Medicine, Subei People's Hospital of Jiangsu Province,Yangzhou225000;2Department of Respiratory Medicine，Affiliated Hospital of Nantong University;3Department of Geriatric Medicine，Subei People's Hospital of Jiangsu Province)

　　[Abstract] Objective:To explore the protective effect of Dexamethasone by observing the change of eNOS protein in the case of pulmonary ischemia-reperfusion before and after the intervention of Dexamethasone in rats.Methods:40 health Sprague-Dawley rats were chosen without considering of their sexes, they were divided randomly into five groups: Sham group(S), ischemia-only group(I), ischemia-reperfusion group (IR), small-dose dexamethasone intervened group (D1),large-dose dexamethasone intervened group(D2), with eight in each group. Rat model of warm ischemia and reperfusion in situ in single lung was prepared on the basis of Eppinger Model. The protein of eNOS in lung tissue was detected by Western blot， and pulmonary pathological changes were observed by HE staining. Result:Compared with other groups, the expression of eNOS protein in Group IR was much lower(P<0.01),which increased after the intervention of Dexamethasone，especially in large dose. The pathological section showed that the pulmonary structural lesion was more serious in Group IR, and the structural lesion was lessened after the intervention of Dexamethasone. Conclusion:The expression of eNOS in normal lung tissue is high, but if the lung is ischemia-reperfusioned, the eNOS decreases obviously while the lung injury is obvious. After the intervention of Dexamethasone，especially in large dose, the eNOS protein increases and Kaminski A, Pohl CB, Sponholz C,the lung injury lessens.

　　[Key Words] Ischemia-reperfusion;Lung;Dexamethasone;Epithelial nitrix oxide synthase;Rat

　　近年来随着肺栓塞溶栓治疗、肺动脉血栓内膜剥除术、肺移植、体外循环手术等心胸外科手术的广泛开展，肺缺血再灌注(I/R)损伤受到临床医师越来越多的关注。地塞米松是临床上常用的糖皮质激素，在我们之前的研究中已经证实其可能通过抑制诱导型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase， iNOS)表达从而减轻I/R带来的肺损伤[1]，而关于一氧化氮合酶(NOS)的另一个亚型内皮型一氧化氮合酶(epithelial nitrix oxide synthase，eNOS)的研究表明其在肺I/R中也扮演重要角色[2]， eNOS主要在肺内内皮细胞、支气管及肺泡上皮细胞表达。本研究的目的就是观察地塞米松对大鼠肺缺血再灌注后eNOS表达的影响从而进一步探讨地塞米松对I/R损伤肺组织的保护机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物分组 健康的SD大鼠40只，雌雄不分，体重250~350 g，由南通大学实验动物中心提供。随机分成5组：假手术组(S组)、单纯缺血组(I组)、缺血再灌注组(IR组)、小剂量地塞米松干预组(D1组)，大剂量地塞米松干预组(D2组)，每组8只。

　　1.2实验方法 根据Eppinger方法建立动物模型，假手术组仅开胸不阻断左肺门，单纯缺血组仅阻断左肺门2 h，不予再灌注，缺血再灌注组、小剂量地塞米松干预组、大剂量地塞米松干预组均阻断左肺门1 h后，给予再灌注2 h，D1和D2组在再灌注前5 min经尾静脉或阴茎背静脉分别注入地塞米松1 mg/kg、5 mg/kg。

　　1.3 标本的采集 各实验组模型制备完成后放血处死大鼠，左肺上部用4%多聚甲醛固定作病理检查，下部放入液氮保存作Western-blot检测。

　　1.4 检测方法 Western印迹：取肺组织提取液蛋白50 μg ,用12%SDS-PAGE 凝胶电泳分离,将电泳条带转移至醋酸纤维膜上, 将膜放入5%脱脂奶粉TBST液中封闭4 ℃过夜。用TBST液洗膜后将膜放入5%脱脂奶粉TBST液稀释(1∶500)的eNOS一抗中(购自武汉博士德公司，产品批号：BA-0364)，室温1 h后4 ℃保存8 h。用TBST液漂洗PVDF膜，将膜放入5%脱脂奶粉TBST液稀释(1∶5000)的二抗中，为辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体(购自武汉博士德公司，产品批号：BA1054), 4 ℃保存2 h。将PVDF膜用TBST液洗后，再将化学发光剂、增强剂按1∶1混合，滴加在膜上，室温孵育5 min。在暗室，胶片放在保鲜膜隔的PVDF膜上，曝光2 min，取出冲洗，凉干。用ECL显色曝光,将胶片曝光结果扫描到计算机，用Quantity One软件进行条带灰度值分析，每次结果以对照组灰度值为参考，其他组条带灰度与对照组之比为其相对值。HE染色：固定、取材、梯度脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、复水、HE染色，观察肺组织学结构改变。

　　1.5 统计学方法 所有数据采用Stata8.0统计软件分析处理，计量资料以x±s表示,组内采用配对资料t检验，组间采用方差分析, P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 病理学改变 采用Egan肺组织学评分标准进行判断。Egan肺组织学评分标准：正常，无损害;轻度：点状炎症;中度：血管周围及支气管周围水肿，血管充血及炎症;重度：肺泡及组织间隙水肿，严重的血管水肿及血栓形成。病理损害分级比较见表1。结果显示：假手术组大鼠肺组织结构正常，肺泡结构清晰，肺间质无充血、水肿，肺泡壁无增厚，肺泡腔无出血和中性粒细胞浸润(图1，见封三);单纯肺缺血组见肺泡间质轻度水肿，少量炎症细胞的浸润，部分肺泡结构破坏(图2，见封三);再灌注组肺间质水肿、增厚，肺泡腔内渗出，并有中性粒细胞浸润和肺组织结构的破坏(图3，见封三);与IR组比较，地塞米松组肺泡结构破坏较IR组轻、炎症细胞浸润减少，细胞肿胀、水肿减轻，尤以大剂量组为显(图4、5，见封三)。

　　2.2 各组大鼠肺组织eNOS蛋白灰度值表达及蛋白条带表达 见表1及图6。正常肺组织eNOS蛋白表达较高，IR组表达明显降低，与其余各组差异皆有统计学意义(P<0.01);D1及D2组较IR组升高(P<0.01)，而与S组及I组差异无统计学意义(P>0.05);D2组较D1组作用更为显著。

　　3 讨 论

　　eNOS在正常状态下即可以催化产生少量NO，主要起生理信使作用, NO通过激活鸟苷酸环化酶(GC)升高细胞内环磷酸鸟苷(cGMP)水平而发挥生物学作用，可减轻血管紧张度。Kaminski等[2]研究发现eNOS在对抗肺缺血再灌注引起的肺损伤中起到积极的作用，具体机制可能有：保护内皮的屏障功能、减少黏附分子(VCAM)的表达和阻止中性粒细胞迁移等，同时eNOS在缺血预适应及低温对I/R肺损伤的保护中扮演不可或缺的作用[3-4]，在我们的实验中，缺血后及再灌注后肺组织中eNOS的表达是下降的，其机制可能为肺血管内皮损伤导致内皮机能障碍所致[5]。结合组织病理及相关肺损伤指标的观察也表明eNOS表达的高低与肺损伤的程度是成反比的，进一步证明了eNOS高表达对缺血再灌注肺损伤是起保护作用的。

　　从我们的实验中发现，大剂量、小剂量地塞米松组肺组织中eNOS蛋白质表达较IR损伤组是上升的(P<0.01),大剂量地塞米松组尤其明显，提示地塞米松可以促进eNOS表达，从而减轻缺血再灌注引起的肺损伤。本实验提示了促进eNOS高表达可能是地塞米松对缺血再灌注肺损伤保护的另一机制。

　　【参考文献】

　　[1] 许文景，倪松石，黄冬云.地塞米松对大鼠肺缺血再灌注损伤保护的研究[J].南通大学学报(医学版)，2008:28(6):439-441.

　　[2] Kaminski A, Pohl CB, Sponholz C,et al.Up-regulation of endothelial nitric oxide synthase inhibits pulmonary leukocyte migration following lung ischemia-reperfusion in mice[J].Am J Pathol,2004,164(6):2241-2249.

　　[3] Kaminski A, Kasch C, Zhang L, et al.Endothelial nitric oxide synthase mediates protective effects of hypoxic preconditioning in lungs Respiratory[J].Physiology & Neurobiology，2007,155(3): 280-285.

　　[4] Zhang L, Kumar S, Kaminski A, et al.Importance of endothelial nitric oxide synthase for the hypothermic protection of lungs against ischemia-reperfusion injury[J].J Thorac Cardiovasc Surg,2006,131(5):969-974.

　　[5] Naseem KM.The role of nitric oxide in cardiovascular diseases[J].Mol Aspects Med,2005,26(1-2):33-65.