氧化苦参碱对癫痫大鼠海马组织内ERK信号转导通路及NR2B表达的影响

　　【摘要】 目的 研究氧化苦参碱(Oxymatrine ,Oxy) 对青霉素致痫大鼠海马内p-ERK 1/2与NR2B表达含量的影响,探讨其抑制癫痫的可能机制。方法 78只SD大鼠随机分为正常组、青霉素(Penicilin,PEN)致痫组、苯巴比妥钠(phenobarbital sodium，PBS)阳性药物对照组和Oxy预处理组,采用免疫组织化学SABC法检测大鼠海马内p-ERK1/2和NR2B阳性神经元在不同时间点的表达。结果 与青霉素模型组比较，Oxy组1.5h大鼠海马内p-ERK 1/2与NR2B 6.0h组阳性细胞数减少( P< 0.01) 。结论 Oxy 拮抗癫痫发作的机制可能与调节癫痫大鼠脑内的p-ERK 1/2水平进而使NR2B的水平降低有关。

　　【关键词】 氧化苦参碱;癫痫;p-ERK 1/2;NR2B

　　Effect on ERK signal transduction pathway in hippocampus

　　of epileptic rats induced by penicillin

　　ZHAO Yan, ZHANG Lin-na, CHEN Xiao-xia, et al.(Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China)

　　[Abstract] Objective To investigate the expression of NR2B and extra cellular signal regulated protein kinase (ERK) signal transduction pathway and the significance in the hippocampus of rats after epileptic seizures induced by PEN (penicillin).Methods 78 healthy SD rats were randomly divided into the normal group, a group induced epilepsy by PEN, a group treated by PBS (Phenobarbital sodium) and a group treated by OXY (Oxymatrine). PEN was intraperitoneally injected and established rat's model of epilepsy. Immunohistochemistry method was used to evaluate p-ERK1 / 2 and NR2B protein expression level changes in hippocampus at different time points. Results In the hippocampus of normal group, no immunoreactivity was detected in p-ERK1/2 and a few immunoreactivity of NR2B was observed. Compared with the PEN group, both the p-ERK 1/2 at 1.5h and NR2B at 6.0h express less in hippocampus in OXY group.Conclusion Following PEN -induced seizure, the activations of ERK in rats in the hippocampus changed at different time points. It is possible that OXY inhibit ERK signal pathway thus reduced the expression of NR2B. Therefore OXY changes the process of pathologic and physiologic reactions in PEN-induced epileptic seizure.

　　[Key words] Epilepsy; ERK signal transduction pathway; NR2B; Oxymatrine

　　氧化苦参碱(Oxymatrine ,Oxy)是从苦豆子中分离提纯具有四环喹嗪结构的生物碱。本室前期实验研究发现并已证实Oxy具有抗癫痫作用。为进一步探讨Oxy可能的抗癫痫机制,本实验通过青霉素致痫大鼠模型,采用免疫组化法检测癫痫大鼠脑组织海马区p-ERK 1/2与NR2B表达含量,探讨二者的关系以及Oxy抗癫痫作用的可能机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物：Sprague-Dawley大鼠(宁夏医科大学实验动物中心提供)，雌雄不限，体重200-250g ,随机分组。

　　1.2 实验试剂及仪器：氧化苦参碱(宁夏紫荆花药业生产,批号为960304) ;苯巴比妥钠(PBS，上海新亚药业有限公司生产,批号为040603) ;青霉素(PEN，宁夏启元药业有限公司生产,批号为050703) ;多聚甲醛(北京益利精细化学品有限公司生产,批号为20020203) ;SABC 试剂盒、浓缩型DAB 试剂盒、磷酸盐缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司生产) 。石蜡切片机、光学显微镜。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 实验动物分组及给药:选取健康SD大鼠(雌雄不拘)78只，随机分为四组(各组按0.5、1.5、6和12h 时间点又分为四组，每组6只)：①正常组：腹腔注射生理盐水。②癫痫组：腹腔注射PEN，从出现Racine分级标准III级发作开始计时。③PBS阳性对照组：预先腹腔注射PBS 10mg/kg。④OXY预处理组：预先腹腔注射Oxy 147.45mg/kg(ED50)。

　　1.3.2 模型复制及大鼠癫痫行为学分级:除正常对照组和癫痫组外,其它各组大鼠0.5h后腹腔注射PEN 600万U/ kg。根据Racine分级法，动物痫性发作III级(前肢阵挛、后肢站立)或III 级以上发作视为达到点燃标准。

　　1.3.3 大鼠脑组织海马区p-ERK 1/2与NR2B阳性神经元测定：(1)灌注和取材： 20% 乌拉坦(1g/kg)腹腔注射，麻醉后开胸沿左心室向升主动脉插管固定，灌入生理盐水冲净血液，然后换4%多聚甲醛戊二醛混合液进行内固定。断头取脑置入固定液中24 h, 石蜡包埋后作冠状切片用于免疫组织化学染色。(2)p-ERK 1/2与NR2B免疫组织化学染色采用SP法。

　　1.4 统计学方法:所有实验数据均用±s表示,采用SPSS 15.1 统计软件进行方差分析和t检验。

　　2 结果

　　2.1 各组动物行为学观察：生理盐水组大鼠活动正常，PBS组表现安静，无癫痫发作。Oxy组在腹腔注射PEN后经20-30min出现须动、点头和咀嚼样动作，但未出现全身强直、阵挛抽搐、跌倒。PEN组大鼠在PEN腹腔注射后经10-15min潜伏期后 ,出现阵发性须动、点头和咀嚼样动作，至0.5h左右有面肌抽动、前肢阵挛、姿势失衡，继之发生全身强直，阵挛抽搐，常反复发作, 2 h后大部分动物停止发作。

　　2.2 免疫组化染色检测:生理盐水组大鼠大脑海马内未见p-ERK1/2阳性神经元且NR2B仅有少量表达。经PEN致痫1.5h后，与生理盐水组相比大鼠海马内p-ERK1/2阳性神经元表达显著增多(P<0.01)，NR2B在6h表达亦明显增多。PBS组、Oxy组在腹腔注射PEN后海马内开始出现p-ERK1/2阳性神经元,同时NR2B阳性神经元逐渐增多。与PEN组相比PBS组、Oxy组大鼠海马内p-ERK1/2阳性神经元表达减少(P<0.01),NR2B表达低于PEN组(P<0.01)。在PEN组、PBS组和Oxy组中p-ERK1/2阳性神经元表达数量在1.5h达到最高值,6 h后表达下降 ;NR2B在6h组表达量最多，以后逐渐下降(表1、图1，见封二)。表1 各组大鼠癫痫发作前后海马内p-ERK1/2和NR2B免疫阳性细胞数注：与生理盐水比较*P<0.01;与癫痫组比较，△P<0.01;生理盐水各时间点p-ERK1/2与NR2B变化不显著，故表中未一一列出

　　3 讨论

　　研究表明，癫痫的发作与中枢神经系统兴奋性氨基酸类与抑制性氨基酸类神经递质的平衡失调密切相关。Glu和GABA是中枢神经系统中最主要的兴奋性与抑制性神经递质,通过抑制和兴奋作用维持着神经元抑制与兴奋的平衡[1]。在癫痫发作过程中，神经元去极化,引起Glu释放增多和(或)摄取减少。细胞外Glu积累过度刺激Glu受体,使钙离子内流,同时伴有钠离子等阳离子内流,造成脑组织痫性放电。钙离子内流形成细胞内钙超载, 钙离子作为第二信使,并激活钙调蛋白依赖白激酶、磷脂酶C等。钙离子的升高还可激活细胞内Ras/Raf/MAPK/ERK途径。可见,NMDA受体(NR)在癫痫发作脑损伤中起关键作用。NR是促离子型谷氨酸受体的一种，由多种亚基组成的异聚体,目前已克隆出的NR亚基有NR1、NR2A-NR2D、NR3A和NR3B [2]。在成年小鼠海马中，NR含有的NR2亚基主要为NR2A和NR2B。NR2B胞内1290-1309位残基是钙调蛋白依赖性蛋白( calcium calmodulin dependent protein kinase II, CaMKⅡ ) 的主要结合位点,在癫痫发作过程中NR2B通过与PSD蛋白的相互作用,影响突触的信号传递。

　　p-ERK1/2信号转导途径除参与正常的细胞反应外，癫痫的发生过程中也检测到海马中其表达增高。在海细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路还可通过调节突触前膜神经递质的释放而影响神经元的兴奋性。p-ERK1/2信号通路可以磷酸化兴奋性突触前膜的突触体素I，导致谷氨酸释放增加，从而促进癫痫发作和神经元的死亡[3]。根据Abdolrahman S Nateri1, GennadijRaivich等人报道，p-ERK1/2可使eIF4E因子从而增加NMDA2B蛋白表达水平并且使cAMP反应性元件结合蛋白(CREB)磷酸化并且参与调节转录使EphrinB2增加。而EphrinB2表达增多导致NR2B磷酸化，二者共同作用最终使癫痫发作程度加重[4]。ERK通路还可能通过影响苔藓纤维重组、胶质细胞增生、突触重塑的机制参与癫痫的发病。

　　【参考文献】

　　[1] Treiman DM1GABAergic mechanisms in epilepsy[J]. Epilepsia ,2001 ,42 (Suppl 3) :8 - 12.

　　[2] Went hold RJ , Prybylowski K, Standley S , et al . Trafficking of NMDA receptors[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol ,2003 ,43 :3352358.

　　[3] YamagataY,JovanvicJN,Czernik AJ,et al. Bidirectional Changes in Synapsin I Phosphorylation at MAPKinase-dependent Sites by Acute Neuronal Excitation in Vivo[J]. Neurochem,2002,80(5):835-842.

　　[4] Abdolrahman S Nateri, Gennadij Raivich. ERK activation causes epilepsy by stimulating NMDA receptor activity [J]. The EMBO ,2007,26: 4891-4901.