C-myc、P53、bcl-2、CD44V6、nm23-H1基因在食管鳞癌中表达及其与预后的关系

　　【摘要】 目的 探讨C-myc、P53、bcl-2、CD44V6、nm23-H1基因在食管鳞癌的表达及其临床病理及预后的关系。 方法 采用免疫组化S-P法检测C-myc、P53、bcl-2、CD44V6、nm23-H1基因在56例食管鳞癌及21例癌旁正常黏膜中的表达。对所有病例进行3年随访。结果 (1) C-myc、P53、bcl-2、CD44V6在食管鳞癌中的阳性表达率均显著高于癌旁正常食管黏膜;nm23-H1在食管鳞癌中的阳性表达率显著低于正常食管黏膜。(2) C-myc表达与肿瘤浸润深度、TNM分期相关;P53表达与肿瘤浸润深度、病理分级及TNM分期相关;bcl-2表达与肿瘤病理分级、TNM分期、淋巴结转移与否相关;CD44V6与nm23-H1表达与肿瘤浸润深度、病理分级、TNM分期、淋巴结转移与否相关。 (3) 单因素生存分析显示肿瘤浸润深度、病理分级、临床分期及淋巴结转移情况以及C-myc、P53、bcl-2、CD44V6、nm23-H1基因表达均与食管癌患者预后相关。Cox回归多因素分析显示食管癌中病理分级、TNM分期、bcl-2、CD44V6、nm23-H1表达是独立预后因素。结论 (1)C-myc、P53、bcl-2、CD44V6的高表达及nm23-H1的低表达与食管鳞癌的发生相关。(2)C-myc、P53、bcl-2、CD44V6、nm23-H1与食管鳞癌浸润转移相关。(3)肿瘤的病理分级、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移及bcl-2、CD44V6、 nm23-H1表达是影响食管癌患者预后的因素。

　　【关键词】 食管癌;C-myc;P53;bcl-2;CD44V6;nm23-H1;免疫组化

　　Study on expression of C-myc, P53, bcl-2, CD44V6, nm23-H1 and clinical pathologic

　　and prognosis in esophageal squamous cell carcinoma

　　YOU Dong, GAO Ping.(The First People's Hospital of Yinchuan, Yinchuan 750001, China)

　　[Abstract] Objective To investigate the expression of gene C-myc, P53, bcl-2, CD44V6, nm23-H1 and clinical pathologic and prognosis in esophageal squamous cell carcinoma.Methods Using immunohistocheical S-P methods, the expression of C-myc, P53, bcl-2, CD44V6, nm23-H1 genes were examined in 56 cases of tumor tissues and 21 cases of normol mucous membrane of esophageal.Results In the tissue of squamous cell carcinoma the expression rate of C-myc, P53, bcl-2, CD44V6 was higher than normal mucous membrane of esophagus tissues significantly, while in the squamous carcinoma tissues the expression rate of nm23-H1 was lower than normal mucous membrane of esophagus tissues significantly (P<0.05); The positive rate of C-myc is related with invasive depth and TNM classiticative (P<0.05). The positive rate of P53 was related with invasive depth, class of pathology and TNM classiticative (P<0.05). The positive rate of bcl-2 is related with class of pathology, TNM classiticative, lymph node metastasis (P<0.05). The positive rate of CD44V6 and nm23-H1 was related with invasive depth, class of pathology, TNM classiticative, lymph node metastasis (P<0.05); The patients of esophageal carcinoma's single factor survival analysis show that the prognosis of patients were related with invasive depth, class of pathology, TNM classiticative, lymph node metastasis and the expression of C-myc, P53, bcl-2, CD44V6, nm23-H. easophageal carcinoma prognosis correlateal Cox multiplicity logical analysis show it is an independent prognosis factor including class of pathology, TNM classification and the expression of bcl-2, CD44V6 and nm23-H1.Conclusion C-myc, P53, bcl-2, CD44V6 are over-expressed and nm23-H1 is low expressed in esophageal squamous cell carcinoma. The expression of genes C-myc, P53, bcl-2, CD44V6 and nm23-H1 are related with invasion and metastasis of esophageal carcinoma and the prognosis of patients are related with invasive depth, class of pathology, TNM classification, lymph node metastasis and the expression of C-myc, P53, bcl-2, CD44V6, nm23-H1.

　　[Key words] Esophageal carcinoma; C-myc; P53; bcl-2; CD44V6; nm23-H1; Immunohistochemistry

　　食管癌初诊患者多为中晚期，手术切除病灶后的5年生存率较低，侵袭、转移是造成食管癌患者死亡的主要原因。肿瘤的侵袭、转移受多基因、多因素、多步骤的控制。本研究应用免疫组织化学方法检测56例食管鳞癌中C-myc、P53、bcl-2、CD44V6、nm23-H1基因的表达，并进行随访，旨在探讨食管鳞癌的发生发展及预后的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料：选取宁夏医科大学附属医院肿瘤外科2001年5月-2004年6月收治并经手术切除的食管癌蜡块标本56例，其中男39例，女17例，年龄39-79岁，中位年龄57岁。肿瘤位于胸上段7例，胸中段29例，胸下段20例。肿瘤≥3 cm 40例，< 3 cm 16例。术后病理按NCCN(2007)标准进行TNM分期：Ⅰ- Ⅱ期32例，Ⅲ- Ⅳ 期24例。组织学分级：Ⅰ级10例，Ⅱ级22例，Ⅲ级24例。有淋巴结转移者29例，无淋巴结转移者27例。全部患者随访3年(生存不足3年随访至死亡)。术前有放、化疗史的，病理为腺癌，上切端阳性，以及有远处脏器转移的患者不在本研究组。另取相应癌旁正常食管黏膜组织21例上切端作为对照。

　　1.2 试剂和方法：C-myc、P53、bcl-2、CD44V6、nm23-H1抗体及免疫组化试剂盒均购自福建迈新生物公司，采用免疫组化S-P法，操作严格按照说明书。用已知阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。

　　1.3 阳性结果判断：食管鳞癌免疫组织化学反应中，C-myc阳性染色标准：细胞核内呈现棕黄色;P53阳性染色标准：细胞核内出现棕黄着色;bcl-2阳性染色标准：胞膜或胞浆呈现棕黄色着色; CD44V6阳性染色标准：细胞膜呈现棕黄色着色;nm23-H1阳性染色标准：胞浆呈现棕黄色颗粒。

　　1.4 评分标准：采用双评分半定量法评分：< 25%细胞阳性为0分;25% - 50%细胞阳性为1分;51% - 75%细胞阳性为2分;>75%细胞阳性为3分;显色度按细胞显色的有无及深浅评分：细胞无显色为0分;浅黄色为1分;棕黄色为2分;棕褐色为3分。然后根据两项之和判断结果。0-2分为(-)，3-4分为(+)，5-6分为(++)。

　　1.5 统计学方法： 采用SPSS 312.0统计软件进行数据处理，食管鳞癌与正常黏膜之间各基因表达分析以及临床病理特征与各基因表达分析均采用χ2检验。采用Kaplain-Meier法分析食管癌各项临床指标，为其预后的影响建立Cox回归多因素模型分析(Forward法)，筛选出影响食管鳞癌预后的独立因素。表1 C-myc、P53、bcl-2、CD44V6、nm23-H1 表达与食管癌临床病理的相关性

　　2 结果

　　2.1 C-myc、P53、bcl-2、CD44V6、nm23-H1蛋白表达：C-myc蛋白在食管鳞癌组织中的阳性表达率为66.1 %(37/56)，在癌旁正常黏膜的阳性表达率为9.5%(2/21)，两者比较有统计学意义(P=0.0000)。P53蛋白在食管鳞癌组织中的阳性表达率为57.1 %(32/56)，在癌旁正常黏膜的阳性表达率为28.6 %(6/21)，两者比较有统计学意义(P=0.0255)。bcl-2蛋白在食管鳞癌组织中的阳性表达率为53.6 %(30/56)，在癌旁正常黏膜的阳性表达率为14.3 %(3/21)，两者比较有统计学意义(P=0.0019)。CD44V6蛋白在食管鳞癌组织中的阳性表达率为57.1 %(32/56)，在癌旁正常黏膜的阳性表达率为23.8%(5/21)，两者比较有统计学意义(P=0.0091)。nm23-H1蛋白在食管鳞癌组织中的阳性表达率为48.2 %(23/56)，在癌旁正常黏膜的阳性表达率为81.0%(17/21)，两者比较有统计学意义(P=0.0018),见图1-5(封二)。

　　2.2 C-myc、P53、bcl-2、CD44V6、nm23-H1 表达与食管癌临床病理的相关性:见表1。

　　2.3 食管鳞癌单因素生存分析:见表2。

　　2.4 食管鳞癌预后Cox 回归多因素分析多因素生存分析:将单因素分析有意义的指标引入Cox回归多因素模型分析，采用Forward法，统计出影响食管癌患者预后的独立因素,见表3。表2 食管鳞癌单因素生存分析(kaplan-Meier法)

　　项目n平均存活时间(月)χ2值P值年龄 > 553525.69±1.620.050.827 ≤ 552125.43±2.32性别 男3926.13±1.480.000.979 女1724.35±2.76肿瘤大小 ≥3 cm4024.38±2.760.550.456 <3 cm1627.38±2.35病理分级 I-II级3228.75±1.669.010.002 III级2421.38±1.86浸润深度 黏膜+肌层3129.13±1.607.870.005 外膜层2521.2±1.90LNM 有2919.21±1.4129.920.000 无2732.44±1.41TNM分期 I-II期3231.69±1.3234.860.000 III-IV期2417.46±1.32C-myc 阳性3724.30±1.3910.720.001 阴性1931.21±2.11P53 阳性3224.59±1.665.670.017 阴性2429.38±1.59bcl-2 阳性3023.73±1.649.140.002 阴性2630.00±1.62CD44V6 阳性3224.22±1.579.570.002 阴性2429.88±1.67Nm23-H1 阳性2730.33±1.4910.390.001 阴性2923.21±1.69表3 食管癌预后相关的Cox回归多因素分析

　　3 讨论

　　食管癌为世界六大常见的消化道肿瘤之一，其发生发展涉及到多个癌基因及抑癌基因的改变。C-myc基因是一种原癌基因，与细胞周期关系密切。研究发现，C-myc基因在细胞增殖分化的调控中起关键作用 [1]。本研究显示食管鳞癌组织中C-myc阳性表达率明显高于正常食管黏膜。C-myc的阳性表达率在不同的TNM分期组中及浸润深度组织中存在统计学意义(P<0.05)，Ⅰ- Ⅱ 期的阳性表达率低于Ⅲ- Ⅳ 期，黏膜+肌层组的阳性表达率明显低于外膜层组。本研究显示C-myc表达阳性者的平均生存时间明显低于阴性表达者。提示随着C-myc基因扩增，肿瘤细胞增殖能力强，肿瘤生长快，易发生侵袭及转移。

　　P53作为促凋亡基因，在细胞凋亡的分子调控中占有重要地位。本研究通过免疫组化法检测突变型P53蛋白[2]，显示在食管鳞癌中的阳性表达率明显高于正常食管黏膜，提示突变型P53蛋白产物的积聚标志着对细胞增殖周期的一种失控，抑制细胞凋亡和促进细胞恶性增殖[3]。P53 表达在不同的TNM分期、浸润深度、病理分级中存在统计学意义(P<0.05)。生存分析显示本研究P53阳性表达者的平均存活时间明显低于阴性者。提示突变型P53不仅通过抑制细胞凋亡，还可能参与肿瘤细胞的浸润过程，在诱导肿瘤细胞分化过程中起一定作用。

　　bcl-2基因是最早发现的细胞凋亡抑制基因，一旦bcl-2基因被激活，导致bcl-2蛋白过度表达，抑制细胞凋亡，延长细胞的生存期[4]。本研究显示，bcl-2在食管鳞癌中的阳性表达率明显高于正常食管黏膜，说明bcl-2过度表达时，将影响食管黏膜的自身稳定性，抑制细胞凋亡，为细胞癌变提供机会。bcl-2表达阳性率在TNM分期、病理分级、淋巴结转移与否，组间存在统计学意义(P<0.05)。Ⅰ- Ⅱ 期中的阳性表达率低于Ⅲ- Ⅳ 期，Ⅰ- Ⅱ级组中的阳性表达率低于Ⅲ级组。有淋巴结转移组中的阳性表达率高于无转移组，并且bcl-2阳性表达者的平均存活时间明显低于阴性者。

　　CD44V6是1991年Gunthert [5]等在大鼠中发现的CD44V6黏附分子的一种变构体。本研究显示CD44V6的表达在TNM分期、病理分级、浸润深度、淋巴结转移与否中存在统计学意义，Ⅰ- Ⅱ 期中的阳性表达率低于Ⅲ- Ⅳ 期，Ⅰ- Ⅱ级组中的阳性表达率明显低于Ⅲ级组;黏膜+肌层组中的阳性表达率明显低于外膜层组;淋巴结转移中的阳性表达率明显高于无转移组。CD44V6仅见于具有转移能力的肿瘤细胞，因此由CD44V6单抗介导的靶向治疗具有良好前景。Sauter [6]等研究抗CD44V6单抗药物bivatuzumab mertansine已进入Ⅰ期临床试验，抗CD44V6单抗不但能特异性地与CD44V6表达阳性的肿瘤细胞结合阻断其促转移作用，并且可携带细胞毒药物和放射性元素增强杀伤肿瘤细胞的作用，从而为肿瘤治疗提供新的途径。

　　本研究采用Kaplain-Meier法对可能影响食管癌患者后生存因素进行单因素分析发现食管癌患者的病理分级、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移情况，C-myc、P53、bcl-2、CD44V6、nm23-H1五基因的表达是影响患者后生存的重要因素。我们将单因素分析有意义的指标引入Cox回归多因素模型分析，发现肿瘤病理分级、TNM分期、bcl-2、CD44V6、nm23-H1表达是食管癌独立预后因素，bcl-2、CD44V6是危险因素，nm23-H1是保护因素。提示bcl-2、CD44V6、nm23-H1可作为判断食管癌预后的生物学标志。

　　【参考文献】

　　[1] Erishman MD, Samuol L, Keiclan RD, et al. Eforced expression of the C-myc oncogene inhibits cell differentiation by precluding entry into distinct predifferentiation state in G0/G1[J]. Mol Cell Biol, 1988, 8: 1614.

　　[2] Gibson MK, Abraham SC, Wau TT, et al. Epidermal growth factor recepter P53 mutation and pathological response predict survival in patients with locally advanced esophageal cancer treated with preoperative chemoradio theropy[J]. Chin Cancer Res, 2003, 17(9): 6461-6468.

　　[3] Shi ST, Yang GY, Wang LD, et al. Role of P53 gene mutations in human esophageal carcinogenesis results from immunohistochemical and mutation analyses of carcinomas and nearby non-cancerous lesions[J]. Carcino genesis, 1999, 20: 591-597.

　　[4] Campos L, Sabido O Rouault JP, et al. Effects of bcl-2 antisense oligodexynucleotideson vitro proliferation and survival of nomal marrow progenitions and leukemia cell[J]. Blood, 1994, 84: 595.

　　[5] Gunthert U, Rudy W, Hofmann M, et al. A new variant of glycoprotein CD44V6 cofers metastasis potential to rat carcinoma cell[J]. Cell, 1991, 65: 13-24.

　　[6] Sauter A, Kloft C, Gronaus, et al. Pharmacokinetics, immunogenicity and safety of bivatuzumab mertansine, a novel CD44V6-targeting immunoconjugate in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck[J]. Int J Oncol, 2007, 30(4): 927-935.