细胞毒性淋巴细胞相关抗原4基因多态性与宁夏地区Graves病的相关性研究

　　作者：康毓芝1,王立斌2,杨宝珍2,师志云2 作者单位：1.宁夏医科大学，宁夏 银川 750004　　2.宁夏医科大学附属医院，宁夏 银川 750004

　　【摘要】 目的 分析细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4，CTLA-4)启动子318C/T位点基因多态性与宁夏地区Graves病(Graves' disease，GD)相关性。 方法 提取61例宁夏地区GD患者和79例正常对照组的外周血白细胞基因组DNA，应用PCR-RFLP技术检测CTLA-4启动子(318)位点C318T的多态性。结果 GD组与正常对照组CTLA-4 C318T CC、CT、TT三种基因型分布(χ2=1.80，P =0.18)和等位基因频率(χ2=1.04，P =0.31)差异无统计学意义。结论 CTLA-4基因SNP-(318)C/T位点可能不是宁夏地区GD的易感基因。

　　【关键词】 细胞毒性淋巴细胞相关抗原4基因;Graves病;基因多态性

　　Association between Cytotoxic T lymphocyte associated antigen4 gene promoter polymorphisms

　　and patients with Graves' disease in Ningxia

　　KANG Yu-zhi, et al.(Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China)

　　[Abstract] Objective To investigate the correlation between polymorphisms within Cytotoxic T lymphocyte associated antigen4 (CTLA-4) gene promoter with the Graves' Disease (GD) in Ningxia people.Methods A case controlled study was performed for CTLA-4 (318 C/T) in the promoter region in 61 patients with GD and 79 healthy individuals. The CTLA-4 genotype of these subjects was examined by polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP).Results In the promoter (318) of CTLA-4 gene, the frequencies of genotypes and C/T allele in GD patients did not differ significantly compared with control subjects(P>0.05). Conclusion The position 318 C/T in the promoter of CTLA4 is not determined to be susceptible to GD in Ningxia population.

　　[Key words] Cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4 (CTLA-4);Graves disease;Gene polymorphism

　　Graves病(Graves disease，GD)是一种T细胞介导的器官特异性自身免疫性疾病，其发病依赖于基因和环境因素的共同作用，病因未明。文献报道,细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)基因多态性与GD有一定关联性，但存在地域和种族的差异[1]。我们采用病例-对照法和聚合酶链式反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术分析CTLA-4(318)C/T的多态性与宁夏地区人群GD发病的相关性。

　　1 对象和方法

　　1.1 标本来源：GD患者组共61例，均为宁夏医科大学附属医院内分泌科2007年1月-2009年5月住院患者，且均为初次确诊病例，选取三代及以上均在宁夏地区居住作为筛选标准，其中男20例，女41例，年龄(43.7±11.5)岁，以患者居住地将其分为固原地区11例，银南地区15例，银川地区19例，银北地区16例。GD诊断依据内科学第6版，病人有甲亢临床症状、体征、血清甲状腺激素同位素检测异常、促甲状腺激素受体抗体(TRAb)阳性和B超检查证实有弥漫性甲状腺肿。另随机选取到本院体检健康者血样79例作为对照组，其中男34例，女45例，年龄(47.41±11.7)岁，并排除甲状腺疾病、糖尿病及其他自身免疫性疾病家族史，与患者无血缘关系，甲功测定在正常范围。

　　1.2 仪器与方法

　　1.2.1 仪器与试剂： Master Cycler PCR扩增仪(Eppendorf，德国);Gel Doc2000凝胶图像分析系统(BIO-RAD，美国)。限制性内切酶Mse I(BioLabs. Inc.New England);Taq DNA酶和全血DNA提取试剂盒均为大连TaKaRa公司生产。

　　1.2.2 外周血白细胞基因组DNA提取：4ml EDTA-Na2抗凝冰冻全血，按试剂盒说明分离提取其外周血白细胞基因组DNA，TE溶解后于-20℃保存。

　　1.2.3 PCR 扩增： CTLA-4(318)C/T位点引物设计据文献[2]，P1：5′GAAGGAT GGT GCTTCACAT 3′;P2： 5′ CTTTGCAGAAGACAGGGATGA 3′。引物由上海生工公司合成。PCR 扩增反应体系：DNA模板2μl，10×Buffer 5μl，25mmol/L MgCl2 3μl，dNTP 4μl，引物(终浓度20μM)各0.5μl，Taq DNA酶2.0 U，加ddH2O至50μl。反应条件为95℃预变性5min后再进入循环，95℃变性20s，56 ℃退火30s,72 ℃延伸30s，共35个循环。末次循环后72 ℃延伸5 min。PCR 产物以1.5 %琼脂糖凝胶100V电泳分离。

　　1.2.4 RFLP分析： 启动子C/T多态性分析,反应体系20μl，Mse I 1μl，10×NEB4缓冲液2μl，BSA 0.2μl，PCR 产物10μl，37 ℃温浴过夜。产物于2%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，扫描成像同时进行基因型鉴定。

　　1.3 统计学方法：采用SPSS 11.5软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间基因型频率、等位基因频率的比较用行×列χ2检验，显著性检验水平为P<0.05。

　　2 结果

　　2.1 酶切结果：含SNP-318(C/T)位点的PCR扩增片段长度为247bp，经MseΙ消化后基因型CC产生226bp和21bp两种片段;基因型CT产生226bp、130bp、96bp、21bp4种片段;基因型TT产生130bp、96bp、21bp 3种片段。其中21bp片段小,难以分辨，见图1(目录后)。

　　2.2 各组CTLA-4(318)基因型及等位基因频率比较：61例GD患者和79例正常对照(NC) 启动子基因型及等位基因频率见表1。对两群体基因型进行遗传平衡的χ2检验(GD组χ2=0.05，P=0.82;对照组χ2=0.04，P=0.84)，基因型频率分布均具有群体代表性。 GD患者CTLA-4基因启动子318C/T位点基因型与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，同样等位基因频率亦无统计学意义，见表1。表1 GD患者和正常对照CTLA4基因SNP-318C/T位点基因型及等位基因频率的比较注：GD组和对照组基因型比较，*χ2=1.80， P=0.18;等位基因频率比较**χ2=1.04，P=0.31

　　3 讨论

　　CTLA-4位于人类染色体2q33，与CD28一样，是一种细胞跨膜分子，参与T细胞的调节。T细胞的应答、活化至少需要两种信号。其中第2信号即“共刺激信号”，由T细胞表面的CD28和APC表面的B7分子相互作用提供。CTLA-4与CD28竞争B7配体，向T细胞传递负性信号，对T细胞增殖具抑制性调节作用，可引起T细胞凋亡。而CTLA-4基因的多态性可能通过改变CTLA-4蛋白的表达或功能而导致个体自身免疫性疾病的发生，表明CTLA-4基因或许是自身免疫性疾病的普遍易感性基因。GD是一种自身免疫性疾病，T细胞应答在GD发病过程中起重要作用，CTLA-4基因突变可能影响CTLA-4与B7亲和力，削弱其对T细胞的抑制作用，导致T细胞异常活化而引起疾病。CTLA-4基因SNP-318C等位基因较T等位基因有更高的促进细胞活化的作用，携带T等位基因时在刺激细胞表面有CTLA-4的高表达，在静止细胞表面有CTLA-4mRNA的表达增加,从而影响CTLA-4的水平[3-5]。

　　目前，国内外虽然有CTLA-4基因多态性与多种自身免疫性疾病之间相关关系研究的报道，但所显示的结果并不完全一致,其原因可能是因为存在种族、地区、遗传背景的差异所导致。如Yanagawa等[6]报道美国白种GD病人与CTLA-4多态性有较少的相关性，而在德国、加拿大及韩国人群中启动子多态性与GD显著相关[7,8]。国内周文旭等[9]研究发现CTLA-4基因启动子318(C/T)的多态性与GD的相关性是由于其与外显子1连锁不平衡，因此它是GD的一个遗传危险标志，但不具有独立易感作用。本研究结果显示GD组与正常对照组的基因型及等位基因频率相比较差异均无统计学意义，提示CTLA-4基因启动子318位点基因多态性与宁夏人群GD无明显关联。

　　CTLA-4是一种具有高度多态性的基因，我们在后续研究中，需进一步增加研究病例数，在基因、蛋白的表达和功能等方面进行更深入研究，以揭示此位点突变对GD作用和致病机理。同时，还要对CTLA-4基因的其他位点进行研究，从而揭示CTLA-4基因与GD发病及地域和民族之间的关联性。

　　【参考文献】

　　[1] BijayV, Simon P.The emerging role of the CTLA-4 gene in autoimmune endocrine pathies [J].Eur JEndocrino,2004, 150: 619-626.

　　[2] Lee SY, Lee YH, Shin C, et al. Association of asthma severity and bronchial hyperrespons-iveness with a polymorphism in the cytotoxic T-lymphocyte antigen-4 gene[J].Clinical Investigations ,2002,122(1): 171-1761.

　　[3] Wells AD, WalshM C, Bluestone JA, et al. Signaling through CD28 and CTLA-4 controls two distinct forms of T cell anergy [J]. J Clin Invest, 2001, 108(6): 895-903.

　　[4] Chistiakov DA, Savost' anovKV,TurakulovRI, et al. Genetic analysis and functional evaluation of the C/T (-318) and A/G (-1661) polymorphisms of the CTLA-4 gene in patients affected with Graves′ disease[J].Clin Immunol，2006, 118: 233-242.

　　[5] Wang XB, Zhao X, Giscombe R, et al. A CTLA-4 gene polymor-phism atposition-318 in the promoter region affects the expression of protein[J].Genes Immun, 2002, 3: 233.

　　[6] Yanagawa T, Hidaka Y, Guimaraes V, et al. CTLA - 4 gene polymer Phism associated with Graves′ disease in a Caucasian population [J]. Journal of Clin Endocrinol Metab, 1995, 80: 41 - 45.

　　[7] Braun J, Donner H , Siegmund T, et al.CTLA4 promoter variants in patients with Graves' disease and Hashimoto's thyroiditis [J].Tissue Atigens, 1998,51 (5)：563 -566.

　　[8] Park YJ, Chung H K, Park DJ, et al. Polymorphism in the promoter and exon 1 of the cytotoxic T lymphocyte antigen-4 gene associated with autoimmune thyroid disease in Koreans[J].Thyroid, 2000, 10 (6):453-459.

　　[9] 周文旭,施秉银,王惠芳,等. 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4基因多态性与自身免疫性甲状腺病的相关性[J]. 西安交通大学学报(医学版),2003,24 (2):170-173.