乳腺癌患者Her2基因FISH法检测的临床应用研究

　　【摘要】 目的 探讨荧光原位杂交技术与免疫组织化学法在乳腺癌组织中检测Her2基因及蛋白的表达，并评估其临床应用价值。 方法 应用免疫组织化学法、荧光原位杂交技术分别检测51例乳腺癌组织中Her2蛋白及基因表达，进行对比分析。结果 51 例乳腺癌组织中Her2蛋白表达(+++)者 15 例(29.41%)，表达(++)者 13例(25.49%)，表达(+)者 14例(27.45%)，表达(-)者 9例(17.65%);51例乳腺癌组织中有19例(37.25%)出现Her2 基因扩增，32 例(62.75%)无扩增。两种方法的检测结果差异无统计学意义(P> 0.05);二者的相关性为(r=0.54，P<0.01)，Her2蛋白表达(+++ 、++、+、-)者，其Her2基因扩增分别为80%、23.08%、28.57%和0。结论 免疫组织化学法可作为检测Her2表达的初筛方法。而对于免疫组织化学检测Her2表达阳性患者，特别是临床选择Herceptin治疗的患者，有必要进一步做荧光原位杂交检测。

　　【关键词】 乳腺癌;Her2表达;荧光原位杂交(FISH)，免疫组织化学法

　　Study of Her2 expressing detection using FISH methods in breast cancer

　　CHEN Yao-ping, YANG Bao-zhen, WANG Qing, et al.(The Affiliated Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China)

　　[Abstract] Objective To study the detection of Her2 expression in breast cancer by using immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization (FISH) methods, and to evaluate their clinical value.Methods The expression of Her2 protein and gene in 51 cases with breast cancer were detected by immunohistochemical staining and FISH, respectively, and then the data was analyzed.Results Of 51 cases, the expression of Her2 protein were strongly positive in 15 cases (29.41%), positive in 13 cases (25.49%), weakly positive in 14 cases (27.45%), negative in 9 cases (17.65%); Her2 gene amplification existed in 19 cases (37.25%). No significant difference was found in the results between the two methods (χ2=3.76, P>0.05), but the correlation coefficient of the two methods was not very well (r=0.539, P<0.01), in the (+++), (++), (+) and (-) of Her2 protein expression, the Her2 gene amplication' was 80%, 23.08%, 28.57% and 0, respectively.Conclusion The immunohistochemistry is regarded as the initial screening method of the detection for Her2 expression. In the cases with positive expression of Her2 protein by immunohistochemistry, it must be further detected by FISH when it selects Herceptin in clinical therapy.

　　[Key words] Breast cancer; Her2 expression; Fluorescence in situ hybridization; Immunohistochemistry

　　乳腺癌是危害女性健康最主要的恶性肿瘤之一，发病率呈逐年上升趋势，尤其在发展中国家[1]。人表皮生长因子受体-2(Human Epidermal growth factor Receptor-2, Her2)为原癌基因，与乳腺癌的发生、发展及预后密切相关，对治疗药物的选择至关重要，尤其是赫赛酊(Herceptin)单抗临床治疗的成功应用。因此，对于乳腺癌的临床治疗，Her2表达的检测显得非常重要，本文通过对比研究乳腺癌组织中免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)和荧光原位杂交法(fluorescence in situ hybridisation,FISH)检测Her2的表达，评估这两种方法对于乳腺癌组织Her2表达检测的临床应用价值。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料:病例选自2008年3月- 2008年9月，宁夏医科大学附属医院手术切除的乳腺癌组织标本51 例，年龄31-74岁，中位年龄50岁，术前均未接受过任何治疗。依据WHO乳腺肿瘤组织学分类法均为浸润性导管癌，组织分级：I级5例，Ⅱ级36例，III级10例。腋淋巴结转移25例，无腋淋巴结转移26例。标本经 10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，4μm 切片，HE 染色证实为乳腺癌。

　　1.2 主要试剂:免疫组化 S-P 试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。Her2-FISH-TM检测试剂盒(美国 VYSIS 公司)购自北京金菩嘉生物技术有限公司。

　　1.3 免疫组化S-P法检测乳腺癌组织切片Her2蛋白表达:试验操作严格按照说明书进行。

　　结果判定标准：光镜观察阳性信号，阳性反应物为棕黄色颗粒，定位于细胞膜。高倍显微镜下观察 10 个视野，没有染色或<30%肿瘤细胞染色为阴性(-)，>30%的肿瘤细胞有不完整细胞膜着色为弱阳性(+)，>30%的肿瘤细胞有较弱但完整的细胞膜着色为阳性(++)，>30 %的肿瘤细胞较强完整细胞膜着色为强阳性(+++)。

　　1.4 FISH 法检测Her2 基因扩增

　　1.4.1 预处理程序:从福尔马林固定石蜡包埋的乳腺癌组织中获取多块4μm切片，分别置于以上经氨基烷基硅烷(aminoalkylsilane)处理过的载玻片上，组织切片置于65℃下过夜烘烤，二甲苯中室温脱蜡，梯度乙醇复水，50℃下用30%(W/V)酸性亚硫酸钠处理组织切片，200μg/ml蛋白酶K 37℃下消化，0.1M HCl室温浸泡，梯度乙醇脱水，丙酮浸泡，自然干燥玻片后，加热玻片至56℃。

　　1.4.2 FISH检测:严格按照FISH操作步骤进行。组织玻片变性，乙醇梯度脱水，玻片自然干燥，45-50℃ 烤片机上预热后与变性好的探针混合物杂交，42℃保温箱中过夜，甲酰胺洗涤方案洗片，暗处自然干燥玻片，DAPI复染，荧光显微镜下观察玻片。

　　结果判定标准：正常细胞：单个间期细胞核中红色及绿色信号各2个。HER-2基因扩增异常细胞：单个间期细胞核中红色信号大于2，且绿色信号不少于2个。计数30个细胞，统计Ratio值(Ratio值=30个细胞核中红信号总数/30个细胞核中绿信号总数)。Ratio<1.8为阴性结果，提示该样本无HER-2基因扩增;Ratio>2.2为阳性结果，提示样本中HER-2基因发生扩增;Ratio在1.8-2.2之间时，可以选择增加计数细胞至100个，或重做FISH实验来判断最终结果。

　　1.5 统计学方法:应用 SPSS13.0 统计软件进行统计分析。IHC和FISH结果采用配对计数资料的 χ2 检验(McNemar 检验)和kappa检验进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 51 例乳腺癌免疫组织化学法检测:IHC和FISH方法的阳性率比较，差异无统计学意义(χ2=3.76，P>0.05),但以IHC检测HER-2蛋白表达阳性率较高;两种检测方法的相关性一般(r=0.539，P<0.01)。乳腺癌中Her2基因扩增及Her2蛋白表达结果见表1 。

　　2.2 Her2蛋白表达：定位于细胞膜，呈棕黄色颗粒;Her2基因扩增信号表现为单个间期细胞核中橘红色信号>2，且绿色信号不<2，见图1-6(封2)。表1 乳腺癌中Her2基因扩增及Her2

　　3 讨论

　　原癌基因Her2的过表达，可能赋予肿瘤细胞生物学方面的优势，Her2肿瘤蛋白是一个跨膜受体蛋白，属于表皮生长因子受体家族，具有信号转导通路上的酪氨酸激酶活性，因此，与生存期短、侵袭性强、远处转移和其他预后差等因素以及化疗方案的选择有关[2,3]。近年来，人源化的抗-Her2单克隆抗体(Herceptin)——曲妥珠单抗的问世，为一部分乳腺癌患者的治疗带来福音，曲妥珠单抗在治疗Her2过表达的乳腺癌疗效已被证实。Herceptin无论与化疗药物联合应用，还是用于辅助治疗，都能肯定地改善Her2过表达患者的生存，使乳腺癌患者获益[4,5]。但是，一方面该药物比较昂贵，另一方面，Her2表达阴性者治疗无效，因此，在选择治疗前，Her2表达状态的检测就显得非常重要。

　　对于乳腺癌Her2表达状态的检测，有传统的IHC、显色原位杂交法(CISH)、FISH、聚合酶链反应法(PCR)等。

　　IHC是目前临床上常用的检测乳腺癌组织中Her2蛋白表达的方法，该方法简便、费用低廉、可重复性好、对材料和实验室的要求不高。但由于蛋白在标本固定和处理过程中容易变性破坏而影响检测结果，以及抗体不同的生产厂家、不同的生产批号产生的差异以及结果判读的主观差异等，使得免疫组化方法难以标准化，其结果的假阳性和假阴性问题无法避免。

　　FISH是分子遗传学常用的检测技术，不仅可以用于异常染色体的检测，也可以用于观察目标基因的扩增情况。是目前公认的检测基因表达的金标准，与蛋白的检测相比，该项技术具有高稳定性、高准确性和高灵敏性以及重复性好的特点。

　　本文对乳腺癌组织标本Her2的表达进行了IHC检测和 FISH 检测的对比研究，结果表明，虽然这两种检测方法对于Her2表达阳性率检出的差异无统计学意义，但两种方法的相关系数只有0.54，这两种检测方法的结果存在较大的差异，HER-2蛋白呈阳性和强阳性表达的样本中，有一部分表现为Her2基因无扩增，文献报道[6]这两种检测方法的相关系数为0.64，本文为0.54。提示IHC检测存在一定的假阳性率和假阴性率，尤其是本研究中IHC检测Her2蛋白表达为(+)者中有28.57%表现为Her2基因扩增，与文献报道有很大差距。这些数据提示，我们需要进一步提高IHC的检测技术，规范检测标准，做好室内质控和室间质评，以期望达到一个统一的检测标准，增加检测结果的精确性。需要积累样本做进一步研究。

　　综上所述，IHC技术由于操作简便、价格低廉的特点，适用于Her2表达的初筛，尤其在发展中国家，但其高的假阳性率和假阴性率，要求其必须改进和标准化，才能体现其价值。而目前，对于选择Herceptin治疗的患者，最好的选择是做Her2 基因的FISH 检测，为临床治疗提供更加准确的信息，也为患者和社会节约一定的资源。

　　【参考文献】

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　　[2] Azambuja E, Durbecq V, Rosa DD,et al.HER-2 overexpression/amplification and its interaction with taxane-based therapy in breast cancer[J]. Ann Onc, 2008,19: 223 - 232.

　　[3] Palmieri D, Bronder LJ, Herring MJ,et al.Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain[J].Cancer Res, 2007, 67: 4190 - 4198.

　　[4] Bullock K, Blackwell K. Clinical efficacy of taxane-trastuzumab combination regimens for HER-2-positive metastatic breast cancer[J].Oncologist, 2008,13: 515-525.

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　　[6] Rossi E, Ubiali A, Cadei M,et al.HER-2/neu in breast cancer: a comparative study between histology, immunohistochemistry, and molecular technique (FISH)[J]. Appl Immunohisto- chem Mol Morphol, 2006,14(2): 127-31.