DBP对雄性小鼠睾丸标志酶活性的影响

　　【摘要】 目的 观察邻苯二甲酸二丁酯(DBP)对雄性小鼠睾丸标志酶活性的影响。方法 选择健康成年雄性昆明种小鼠130只，随机分为13组，每组10只。分别对小鼠进行相同作用时间、不同剂量及相同剂量、不同作用时间的DBP腹腔注射染毒。相同作用时间、不同剂量染毒组5组，即0(对照组)、250、500、1000和2000mg/(kg·bw)，1次/d，连续染毒3d。相同剂量[4000mg/(kg·bw)]、不同作用时间染毒组共8组，即0(对照组)、0.5、4、12、24、36、48和72h。测量小鼠脏器湿重、睾丸细胞乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)。结果 DBP可引起小鼠睾丸组织匀浆中LDH、G-6-PD活性升高;DBP一次进入体内所引起的睾丸标志酶活性变化可在72h恢复正常水平。结论 DBP对雄性小鼠具有一定的生殖毒性。

　　【关键词】 邻苯二甲酸二丁酯;乳酸脱氢酶;葡萄糖-6-磷酸脱氢酶

　　Effect of DBP on enzyme activities in testis in male rats

　　LI Ling, FAN Xue-min, LIU Gui-zhu, et al.(Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China)

　　[Abstract] Objective To study the effects of DBP on enzyme activities in testis in male rats. Methods The adult Kunming rats were randomly divided into 13 groups. Then peritoneal injected with DBP at the same time with the different dose and the same dose with the different time. There were 5 groups in same time with different dose: 250mg/kg, 500mg/kg, 1000mg/kg, 2000mg/kg and control group (Coin Oil), once a day for 3 days. The same dose different time were 8 groups in total, they were 30min, 4h, 12h, 24h, 36h, 48h, 72h and control group (Coin Oil). The organ weights were measured and the activity of LDH and G-6-PD were measured in testicle samples. Results DBP can cause testicle samples LDH activity increased, G-6-PD activity increased. The enzyme activities in the testis come to normal at 72h after administering with DBP one time. Conclusion DBP could affect the reproductive system of male rats.

　　[Key words] Dibutyl phthalate (DBP); LDH; G-6-PD

　　目前国内的研究多集中于其拟雌激素样作用上，而对其对睾丸标志酶活性的影响的研究还比较少。本研究通过对小鼠相同作用时间、不同剂量及相同剂量、不同作用时间的邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP)染毒，探讨邻苯二甲酸二丁酯对小鼠睾丸组织中酶活性的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 试验材料：体重18-25g健康成年昆明种雄性小鼠130只(普通级，购于宁夏医科大学实验动物中心)饲养于不锈钢笼具中，饲养过程中自由进食和饮水，每天换水和加食1次，保持房间温度(22±3)℃、湿度(60±10)%。经适应性饲养1周后，按体重随机分组。受试物：DBP，成都科龙试剂公司生产。试剂：考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购于南京建成生物工程研究所;葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)试剂盒购于北京众磊生物发展有限公司。仪器：722型分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)、低温高速离心机(涟水电讯电机厂)、恒温水浴锅(北京医疗设备总厂)、分析天平(Mettler Toledo Group)、显微镜(Olympus)、电子天平、酶标仪。

　　1.2 剂量分组与染毒方法

　　1.2.1 相同作用时间、不同剂量染毒组：剂量分别为0(对照组)、250、500、1000和2000mg/(kg·bw)，每组10只。各组按1ml/(100g·bw)腹腔注射1次/d，0剂量组只给玉米油。连续染毒3d，每天称重，根据体重变化调整给药量。第4天将动物处死。

　　1.2.2 相同剂量、不同作用时间染毒组：将80只小鼠随机分为8组，每组10只。实验组每组按1ml/(100g·bw)腹腔注射DBP 4000 mg/(kg·bw)，分别于给药后0.5、4、12、24、36、48、72h处死动物;0剂量组按1ml/(100g·bw)腹腔注射玉米油，于给药4h后处死。

　　1.3 观察指标

　　1.3.1 一般中毒症状和体征：观察小鼠体重、饮食和水、活动情况及一般中毒表现。

　　1.3.2 睾丸、肾脏及甲状腺重量的测定：各组小鼠称重后，脱臼处死，取睾丸、肾脏、甲状腺称重，计算脏器系数。 脏器系数=脏器的重量/体重×100%

　　1.3.3 睾丸细胞酶活性的测定：采用南京建成生物工程研究所的试剂方法(比色法)。

　　1.4 统计学方法：采用SPSS11.5统计软件，统计数据用均数±标准差(±s)表示。

　　2 结果

　　2.1 一般情况：染毒期间各组小鼠一般健康情况良好，未见全身中毒症状，无死亡。

　　2.2 小鼠睾丸、肾脏及甲状腺重量的测量结果：结果如表1所示，睾丸系数2000mg/(kg·bw)组明显高于对照组(P<0.05);甲状腺系数1000mg/(kg·bw)和2000mg/(kg·bw)组明显低于对照组(P<0.05);肾脏系数无明显变化。表1 睾丸、肾脏及甲状腺脏器系数的比较

　　2.3 睾丸细胞酶活性测定结果

　　2.3.1 相同作用时间、不同剂量：结果如表2所示，LDH活性各组明显高于对照组(P<0.05);G-6-PD活性250mg/(kg·bw)组较对照组无统计学意义(P>0.05)，其余各组均明显高于对照组(P<0.05)，且随着染毒剂量的增加而明显升高。表2 各组睾丸标志酶的比较

　　2.3.2 相同剂量、不同作用时间：结果如表3所示，DBP染毒后0.5-24h，LDH活性上升至最高，此后开始下降，降至72h恢复正常水平且保持平衡状态;G-6-PD活性在DBP染毒后4h开始上升，在12 h时达到最高峰，之后开始下降，至48h基本恢复至正常水平且保持平衡状态。

　　3 讨论

　　3.1 DBP对脏器系数的影响：动物脏器系数可较好地反映化学毒物对该脏器的综合毒害作用，也是寻找毒物作用靶器官的重要线索[1]。本研究结果显示，表3 各组睾丸标志酶的比较睾丸系数高剂量染毒组明显高于对照组，表明DBP可能对雄性小鼠的生殖系统有明显损伤作用，导致小鼠睾丸充血、水肿、重量增加;甲状腺系数高剂量染毒组明显低于对照组，表明DBP对甲状腺造成了损伤。

　　3.2 不同剂量DBP对小鼠睾丸细胞酶活性的影响：LDH主要位于睾丸精曲小管的支持细胞和生精细胞胞质内，参与能量代谢并与生精上皮的成熟有关，是生精细胞成熟的标志酶之一[2]。该酶活性受限将阻碍能量的供给，逐渐导致细胞变性。Fukuoka等研究表明，DBP可引起染毒大鼠睾丸LDH活性下降[3,4]。王玉帮等研究显示，DBP灌胃染毒大鼠2周时，睾丸匀浆LDH活性呈现先上升后下降的趋势，但在染毒4周后血清和睾丸匀浆的LDH活性在1000 mg/(kg·d)剂量组略有下降[5]。本研究各剂量组的DBP均能引起雄性小鼠睾丸LDH活性升高，提示各剂量的DBP都可能使生精细胞造成损伤，导致生精细胞的能量代谢活动代偿性的增强，进而促进生殖细胞的能量供给，从而使LDH活性增加，用以协助恢复生精细胞功能，其引起机体代偿的机制有待于进一步研究。

　　G-6-PD存在于生精小管的间质细胞、支持细胞和精原细胞内，尤以间质细胞中活性最强，是反映间质细胞功能的指标[6]。本研究结果显示，G-6-PD活性250μmol/kg组较对照组差异无统计学意义(P>0.05)，其余各染毒组均高于对照组(P<0.05)。提示可能在高剂量染毒时，生精细胞受到损伤，导致间质细胞的能量代谢活动代偿性的增强，从而使G-6-PD活性增加，用以协助恢复生精细胞功能。

　　3.3 染毒后小鼠睾丸细胞酶活性随时间变化：(1)LDH活性随时间变化。DBP染毒后0.5-24h，LDH活性上升至最高，然后开始下降，降至72h恢复正常水平且保持平衡状态。这表明在DBP染毒初期(0.5-24h)，生精细胞为了拮抗DBP的类雌激素作用而分泌较多的LDH，为生殖细胞成熟分化提供足够的能量。但随着时间的延长(24-72h)，循环血液中的DBP经过肝脏代谢、肾脏排泄而含量逐渐减少，生精细胞功能逐渐恢复正常，LDH活性也由最高点开始下降，至72h体内的DBP基本清除，LDH活性基本恢复正常并保持稳定。(2)G-6-PD活性随时间变化。G-6-PD活性在DBP染毒后4h开始上升，在12h时达到最高峰，之后开始下降，至48h基本恢复至正常水平且保持平衡状态。表明在DBP染毒初期(4-12h)，间质细胞为了拮抗DBP的类雌激素作用而功能亢进，使G-6-PD活性上升。但随着时间的延长(12-48h)，循环血液中的DBP经过肝脏代谢、肾脏排泄而含量逐渐减少，支持细胞功能逐渐恢复正常，进而G-6-PD活性也由最高点开始下降，至48h体内的DBP基本清除，G-6-PD活性恢复正常并保持稳定。从图1和图2中我们可以看出G-6-PD活性的变化比LDH活性更敏感，达到高峰值的时间更短，说明DBP对间质细胞、支持细胞、精细胞的影响比对生精小管和生精上皮细胞的影响更明显。

　　【参考文献】

　　[1] 黄雅卿,张文昌,李煌元.镉对雌性大鼠体重变化和卵巢脏器系数的影响[J].职业与健康,2003,19(7):7-9.

　　[2] Sinha N, Narayan R, Saxena DK. Effect of endosulfan on the testis of growing rats[J]. Bull Environ Contam Toxicol, 1997,58(1):79-86.

　　[3] Fukuoka M, Kobayashi T, Zhou Y, et al. Mechanism of testicular atrophy induced by di-n-butyl phthalate in rats. Part 4 Changes in the activity of succinate dehydrogenase and the levels of transferrin and ferritin in the Sertoli and germ cells[J]. Appl Toxicol，1993，13(4):241-246.

　　[4] Zhou Y, Fukuoka M, Tanaka A. Mechanism of testicular atrophy induced by di-n-butyl phthalate in rats. Part 4. Changes in the activity of succinate dehydrogenase and the levels of transferrin and ferritin in the Sertoli and germ cells[J]. Appl Toxicol, 1990,10(6):447-453.

　　[5] 王玉邦,宋玲,朱正平,等.邻苯二甲酸二丁酯对大鼠睾丸生化酶及脂质过氧化的影响[J].中华男科学杂志,2004,10(10)：729-732.

　　[6] White R, Jobling S, Hoare SA, et al. Environmentally persistent alkylphenolic compounds are estrogenic[J]. Endocrinology, 1994,135(1):175-182.