四种疾病感染的HP 东亚型cagA基因型分布

　　【摘要】 目的 探讨胃病患者感染幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)cagA基因亚型的分布状况。方法 收集感染HP的慢性浅表性胃炎、十二指肠球溃疡、慢性萎缩性胃炎、胃癌患者胃镜活检标本，采用OMEGA E.Z.N.A.TMTissue DNA Kit 试剂盒直接从胃黏膜组织中提取HP基因组DNA进行cagA基因亚型检测，并对cagA基因亚型与特定疾病间的关系进行分析。结果 慢性浅表性胃炎患者感染的HP cagA东亚型阳性率为70%(14/20);十二指肠球溃疡为90%(18/20);慢性萎缩性胃炎为93.5%(29/31);胃癌为94.7%(18/19)，四种疾病所感染的HP菌株均未检测出西方型cagA基因亚型。四种疾病感染的HP 东亚型cagA基因型分布差异有统计学意义(P<0.05)。结论 宁夏地区HP cagA基因亚型以东亚型为主，可能是本地区胃癌高发的原因之一。

　　【关键词】 幽门螺杆菌;CagA;基因型

　　Distribution of cagA genotype of Helicobacter pylori in Ningxia

　　XIE Juan, et al. (Ningxia Medical University Ningxia, Yinchuan 750004, China)

　　[Abstract] Objective To investigate the prevalence and correlations of cagA of Helicobacter polyri (HP) in patients with upper gastric disease in Ningxia. Methods Gastric biopsies collected from the patients with gastric disease who were infected with HP in Ningxia. Helicobacter pylori DNA was isolated by the E.Z.N.A. Tissue DNA kit. The prevalence and genetic diversity in cagA sequence were studied by the technique of polymerase chain reaction (PCR).Results The cagA-East Asian positive rate of chronic superficial gastritis was 70% (14/20); the rate of duodenal ulcer was 90% (18/20); the rate of chronic atrophic gastritis was 93.5% (29/31); the rate of gastric cancer was 94.7% (18/19). The cagA-Western genotype was not detected among these four chronic gastric. There was significant difference in distribution of cagA -East Asian in Ningxia.Conclusion HP with cagA-East Asian is the dominant genotype in gastric diseases patients in Ningxia, distribution of cagA genotype is significant different gastric diseases patients.

　　[Key words] Helicobacter pylori; CagA genotype; Polymerase chain reaction (PCR)

　　幽门螺杆菌(Helcobacter pylori,HP)是引起人类慢性胃、十二指肠疾病的主要致病菌。流行病学资料显示，全球半数以上的人群存在HP感染，但大多数感染者胃内并不发生病变，或表现为轻度慢性胃炎，仅有小部分感染者发展为萎缩性胃炎、消化性溃疡、胃癌、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤等严重疾病[1]，认为与HP菌株毒力不同以及人群易感性差异有关 。本研究对宁夏地区HP进行cagA基因亚型的检测，探讨该地区HP cagA基因型t的分布及其与当地各种胃肠疾病的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 选取2008年2月-2009年2月于宁夏医科大学附属医院接受内镜检查的、并经快速尿素酶实验证实HP强阳性的慢性胃、十二指肠疾病患者100例，年龄25-67岁，平均年龄(46±16)岁;慢性浅表性胃炎20例、十二指肠球溃疡20例、慢性萎缩性胃炎31例、胃癌19例。所有病例均经胃镜和病理学检查确诊。

　　1.2 主要仪器和试剂：PCR扩增仪和凝胶成像系统为美国BIO-RAD公司产品;OMEGA公司E.Z.N.A. Tissue DNA Kit 购自上海贝基生物有限公司;Promega公司的Go Taq Colorless Master Mix以及天根公司的50bp DNA Marker 购自宁夏银川市莱宝信生物有限公司.

　　1.3 方法

　　1.3.1 标本的收集:对100例快速尿素酶实验强阳性的患者于胃窦部大、小弯侧取胃黏膜组织各2块，放入高压消毒的无菌EP管，于-80℃保存。

　　1.3.2 HP基因组DNA的提取：所有用于DNA提取的胃黏膜标本均做病理切片HE染色证实HP阳性之后，采用OMEGA公司的E.Z.N.A. Tissue DNA Kit直接于HP阳性的胃黏膜组织中提取HP DNA基因组[2]，-20℃保存备用。

　　1.3.3 引物设计合成：HP cagA东亚型和西方型特异性引物[3]均由上海生物工程有限公司合成(表1)。表1 cagA基因亚型的PCR引物

　　扩增区域引物引物序列PCR产物(bp)cagA-East AsianForward primer5'-AAA GGA GTG GGC TTC A-3'92Reverse primer5'-CCT GCT TGA TTT GCC TCA TCA-3'cagA-WesternForward primer5'-AGG CAT GAT AA GAT GAT -3'92Reverse primer5'-AAA GGT CCG AGA TCA T-3'1.3.4 PCR反应：采用50μl反应体系：即特异性PCR反应。

　　1.3.5 基因型的检测：凝胶成像分析仪观察记录结果(见图1，目录后)。

　　1.3.6 测序由大连宝生物有限公司完成(克隆后测序),测序结果与Gene Bank相符。

　　1.3.7 统计学方法：采用SPSS11.5软件对数据进行χ2检验和Fisher确切概率法检验，以P<0.05为差别有统计学意义。

　　2 结果

　　PCR结果:100例中，慢性浅表性胃炎患者感染的HP cagA东亚型阳性率为70%(14/20);十二指肠球溃疡为90%(18/20);慢性萎缩性胃炎为93.5%(29/31);胃癌为94.7%(18/19)，四种疾病均未检测出HP cagA西方型。慢性浅表性胃炎患者与十二指肠球溃疡、慢性萎缩性胃炎、胃癌这三种疾病的患者所感染HP cagA基因亚型频率分布差异有统计学意义，而十二指肠溃疡、慢性萎缩性胃炎、胃癌患者之间感染的cagA基因亚型频率分布差异无统计学意义。

　　3 讨论

　　Kersulyte[4]等对来自世界不同地区的500多株HP中等cagA等位基因序列的研究结果发现，存在两种cagA等位基因类型，其中存在于大部分亚洲菌株为东亚型，主要存在于美国和欧洲的菌株为西方型。目前认为，东、西方HP菌株cagA基因的分布差异有统计学意义[5]，在欧美国家中HP cagA阳性率约为50%-60%，而亚洲地区，特别是日本、韩国和中国大陆地区HP cagA阳性率在90%以上。本研究证实本组病例的HP菌株cagA基因亚型以东亚型为主。

　　日本的Satomi等的研究提示HP胃癌菌株与球溃疡菌株的起源不同，cagA东亚型菌株与胃癌密切相关，而大多数球溃疡菌株归类于西方型基因簇。本研究中宁夏地区HP cagA基因亚型以东亚型为主，在中国其他地区进行的研究也得到了相似的结果，张茂俊[6]等测定来自北京、云南、福建的HP cagA基因亚型，93%的中国HP菌株为cagA东亚型，均未检测出cagA西方型。在本研究中cagA东亚型基因在感染HP的慢性浅表性胃炎、十二指肠球溃疡、慢性萎缩性胃炎、胃癌这四种疾病中的阳性率分别为70%、90%、93.5%、94.7%，分布差异有统计学意义，与宁夏医科大学附属医院消化内科前期研究-血清Hp抗体检测cagA抗体的阳性率在慢性胃炎组、消化性溃疡组、胃癌组分别为87. 5%、90. 9%和93.4%，与正常对照组69. 7%的阳性率相比差异有统计学意义(P<0. 05)的结果[7]相符。研究证明cagA东亚型基因是Hp高毒力株的标志基因,与慢性萎缩性胃炎、消化性溃疡、胃癌的发生密切相关，宁夏是中国胃癌最高发的地区之一，本研究提示宁夏人群感染的HP菌株以东亚型cagA基因型为主，可能是宁夏地区胃癌高发的因素之一。但本研究的结果显示本组病例中其他疾病所感染的HP也为cagA东亚型，与Satomi等人的研究结果不符，其原因考虑， Hp感染导致不同的临床结果以及影响疾病预后的原因,除与不同cagA亚型有关外，还与其他HP毒力基因型、环境因素以及宿主的易感性存在一定的关系。Hp的特定毒力基因类型与慢性胃、十二指肠疾病的相关关系还需要进一步的研究。

　　【参考文献】

　　[1] 郑青，萧树东.幽门螺杆菌基因多态性的地域差异对感染临床结局的影响[J].胃肠病学，2007，12(5)：263-266.

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　　[3] Yamazaki S, Kato S, Matsukura N, et al. Identification of Helicobacter pylori and the cagA genotype in gastric biopsies using highly sensitive real-time PCR as a new diagnostic tool[J].FEMS Immunol Med Microbiol, 2005,44:261-268.

　　[4] Kersulyte D, Mukhopadhyay AK, Velapatino B, et al. Differences in genotypes of Helicobacter pylori from different human population[J].Bacteriol, 2000, 182(11):3210-3218.

　　[5] Azuma T, Yamazaki S, Yamakaw A, et al. Association between diversity in the Scr homology 2 domain coataining tyrosine phosphatase binding site of Helicobacter pyloricCagA protein and gastric atrophy and cancer[J]. J Infect Dis，2004,189(5):820-827

　　[6] 张茂俊，何利华，王振宇，等.幽门螺杆菌中国菌株致病相关基因cagA、iceA、vacA及HP0519分布分析[J].中华流行病学杂志，2006，27(6):508-512.

　　[7] 王美丽，杨力.肿瘤坏死因子基因多态性及幽门螺杆菌感染与胃十二指肠疾病及胃癌的相关性研究[J].宁夏医学杂志.2008，30(2)：103-105.