caspase3、bcl-2蛋白在乳腺癌中表达的临床病理研究

　　【摘要】 目的 探讨caspase3、bcl-2蛋白在乳腺癌进展过程中表达的临床及病理意义。 方法 采用免疫组织化学观察caspase3和bcl-2蛋白在乳腺癌中的表达情况。 结果 免疫组化检测乳腺癌caspase3蛋白表达阳性率显著性低于乳腺良性病变(χ2=32.983 ，P=0.000);乳腺癌中caspase3蛋白表达阳性率越低，临床分期越高(χ2=9.184，P=0.010)。乳腺癌中bcl-2蛋白表达阳性率显著性高于乳腺腺病及乳腺纤维腺瘤(χ2=9.790 ，P=0.007)，bcl-2在乳腺癌中蛋白表达阳性率越高，临床分期越高(χ2=13.894 ，P=0.000)。乳腺癌caspase3蛋白表达与bcl-2蛋白表达呈显著性正相关(χ2=8.302，P=0.004)，两因子蛋白表达的协同作用与临床分期的关系比其中任一单因子与临床分期的关系更密切(t=15.459 ，P=0.0063)。结论 caspase3、bcl-2蛋白检测可作为临床评价乳腺癌生物学行为及判断预后的重要参考指标。

　　【关键词】 乳腺癌;bcl-2;天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3;免疫组化

　　Expression of bcl-2 and caspase3 protein and its clinical significance in breast cancer

　　HEI Jing-ya, HUANG Ling-yan, ZHANG Jian-zhong.(Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China)

　　[Abstract] Objective To investigate the protein expression of caspase3 and bcl-2, to reveal the correlation between their expression and clinical-pathology parameters in breast cancer.Methods The data of clinic and pathology with 21 cases of adenosis of breast, 21 cases of fibroadenoma of breast, and 96 cases of breast cancer was respectively collected. All specimen were evaluated by histopathology, correlationship of these factors was analyzed.Results The positive rate of caspase3 protein expression in adenosis, fibroadenoma and carcinoma of breast was 85.72% (18/21), 61.90% (13/21) and 23.96% (23/96), respectively. The positive rate of caspase3 protein expression in breast cancer was significant lower than them in the benign disease of breast ( χ2=32.983 ，P=0.000). With the positive rate of caspase3 protein expression in breast cancer was lower, the clinical stages became higher ( χ2=9.184, P=0.010). The positive rate of bcl-2 protein expression in breast cancer was significant higher than them in the benign disease of breast (χ2 =9.790, P=0.007). With the positive rate of bcl-2 protein expression in breast cancer increased, the clinical stages became higher (χ2 =13.894, P=0.000). There was significant positive correlation between caspase3 and bcl-2 protein expression in breast cancer. The correlation between cooperation effect of them and clinical stages (T=15.459, P=0.0063). It was closer than it between any one of them and clinical stages.Conclusion The positive rate of caspase3 and bcl-2 protein expression of breast cancer has important value to evaluate the malignant or benign disease of breast. Both of them can affect the development of breast cancer together.

　　[Key words] Breast cancer; bcl-2; Cyserinly aspartate-specific protease 3 (caspase3); Immunohistochemistry

　　天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶3(cyserinly aspartate-specific protease 3，caspase3)是细胞凋亡调控的重要因子,它一般以23ku的无活性前体存在于细胞质中,当细胞进入凋亡时才被激活,其可以针对任何刺激使细胞发生凋亡[1]。bcl-2基因是通过抑制细胞凋亡,延长细胞寿命而导致异常细胞的积聚[1]。凋亡相关基因caspase3及bcl-2基因是否通过凋亡机制影响乳腺癌的发生发展及二者在此过程中是否相互作用尚不清楚，本实验通过检测乳腺癌中caspase3与 bcl-2基因蛋白表达情况对此问题做一探讨。

　　1 材料和方法

　　1.1 一般资料：研究材料来自2001—2005年宁夏医科大学附属医院的乳腺腺病、乳腺纤维腺瘤及乳腺癌手术患者138例，术前均未进行过放化疗。其中乳腺腺病21例参考年龄为24-74岁，中位年龄47岁。乳腺纤维腺瘤21例参考年龄为25-53岁，中位年龄38岁。肿块最大直径1.5-5cm，平均(2.59±1.2)cm。96例乳腺癌年龄为28-80岁，中位年龄48岁。癌灶最大直径0.3-10 cm，平均(3.37±1.2)cm。49例无淋巴结转移，47例有淋巴结转移。临床分期按照乳腺癌TNM分期系统(第六版)[9]进行。

　　1.2 试剂与方法

　　1.2.1 免疫组化实验中单克隆鼠抗人IgG抗体caspase3(克隆号：3CSP01，NeoMarker Fremont公司)、bcl-2(克隆号：100)及S-P免疫组织化学染色试剂盒均购自福州迈新生物技术公司。

　　1.2.2 方法：标本均经10%中性福尔马林固定，常规取材石蜡包埋，切片厚4μm，用常规HE染色光镜观察。免疫组化操作按产品使用说明书进行，以迈新生物技术公司的教学切片为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照，3，3’—二氨基联苯胺DAB显色。

　　caspase3及bcl-2蛋白均表达于细胞质，染色结果分4个级别：阴性(-)，阳性细胞数<5%;弱阳性(+)，阳性细胞数5%-25%;中度阳性(++)，阳性细胞数26%-50%;强阳性(+++)，阳性细胞数>50%。

　　1.3 统计学方法

　　利用SPSS 11.5 统计软件进行数据统计，主要方法为卡方检验。以P<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 caspase3蛋白表达结果：21例乳腺腺病和21例乳腺纤维腺瘤中caspase3蛋白表达阳性率分别为85.72%(18/21)和61.90%(13/21)，病灶组织腺体caspase3蛋白表达以强阳性及中等强度为主，与病灶旁正常腺体的蛋白表达强度相近;乳腺癌细胞中caspase3蛋白表达阳性率以中等强度及弱阳性为主，阳性表达率为23.96%(23/96)，癌灶旁正常乳腺腺体的蛋白表达则以强阳性及中等强度阳性为主。乳腺癌Caspase3蛋白表达阳性率显著性低于乳腺良性病变(χ2=32.983，P=0.000)。提示差异有统计学意义。

　　表1可见随着乳腺癌caspase3蛋白表达阳性率越低，临床分期有显著性增高的趋势(χ2=9.184，P=0.010)，在不同分期中，乳腺癌细胞caspase3蛋白表达强度之间差异无统计学意义。表1 乳腺癌caspase3蛋白表达和临床分期的关系

　　2.2 bcl-2蛋白表达结果：乳腺癌bcl-2蛋白表达主要以中等强度阳性为主，阳性表达区域主要以不规则形片状分布为主，分化差的实性区域则以强阳性为主且分布较为弥漫;癌灶周围正常乳腺腺体bcl-2蛋白表达以中等强度及弱阳性为主，分布较为均匀弥漫，与乳腺腺病及乳腺纤维腺瘤bcl-2蛋白表达强度相近。乳腺癌bcl-2蛋白表达阳性率显著性高于乳腺良性病变(χ2=9.790 ，P=0.007)，表2。表2 三种疾病bcl-2蛋白表达结果在不同临床分期中，乳腺癌bcl-2蛋白表达阳性强度没有明显差别，卡方检验表明bcl-2蛋白表达阳性率越低，乳腺癌临床分期有显著性增高的趋势(χ2=13.894 ，P=0.000)。

　　2.3 乳腺癌中caspase3蛋白表达与bcl-2蛋白表达的关系：分析乳腺癌caspase3蛋白表达与bcl-2蛋白表达的关系，96例乳腺癌中caspase3与bcl-2蛋白表达同时阳性者20例，同时阴性者34例，卡方检验乳腺癌中caspase3蛋白表达与bcl-2蛋白表达的关系呈显著性正相关(χ2=8.302，P=0.004)。

　　分析乳腺癌bcl-2、caspase3联合蛋白表达与临床分期的关系，乳腺癌bcl-2和caspase3蛋白表达同时阳性的比率在临床1、2、3期为65.38%(17/26)、15.38%(4/26)、0%(0/3)，进行秩和检验的统计学处理可见乳腺癌bcl-2和caspase3蛋白表达同时阳性率的比率越高，临床分期越低(t=15.459 ，P=0.0063)，P<0.05;两个因子协同作用与临床分期的关系比其中任一单因子与临床分期的关系相对更为密切。

　　3 讨论

　　caspase3基因是1994年Femandes-Alnemri等[2]利用RT-PCR技术从T淋巴细胞文库中筛选得到的，其编码产物为32α和32β两型。人体caspase3基因定位于4q32-4q35.1处。正常情况下细胞质中的caspase3无活性，以酶原的形式存在，当细胞接受凋亡刺激时，它被系列反应激活，进而诱导细胞发生凋亡[3]。有证据表明，细胞凋亡的某些特征性标志，如染色体凝聚和DNA片段化等，均与caspase3有关[4]。Winter[5]用免疫组化方法研究了caspase3在前列腺癌中的蛋白表达情况，发现与正常前列腺组织比较，caspase3在前列腺癌中蛋白表达缺失。Hoshi等[6]发现caspase3在胃癌组织中的蛋白表达阳性表达率明显低于癌旁胃黏膜组织，认为caspase3蛋白表达降低使胃癌细胞凋亡受抑可能参与了胃癌的形成。孙宝华等[7]研究也显示，在分化差的原发性肝细胞癌中caspase3蛋白表达阳性率显著性低于分化好的原发性肝细胞癌，提示caspase3蛋白表达降低与原发性肝癌的进展存在一定关系。与相关报道一致，本研究结果中caspase3基因在乳腺良性病变与乳腺癌组间比较蛋白表达阳性率差异具有统计学意义，乳腺癌Caspase3蛋白表达阳性率显著性低于乳腺良性病变，提示caspase3基因蛋白表达下调与乳腺癌的发生有一定关系。分析caspase3蛋白表达与乳腺癌临床分期的关系，结果表明，caspase3蛋白表达阳性率越低，临床分期呈显著性增高，表明其在乳腺癌进展过程中可能发挥作用，并与乳腺癌的恶性程度密切相关。故可认为caspase3作为凋亡的核心蛋白酶，其表达下调和缺失，可能使恶性肿瘤在形成过程中逃避集体细胞凋亡的自我调节，得以不断增殖，最终形成肿瘤并与恶性肿瘤的进展存在密切关系[9]。

　　bcl-2原癌基因是在滤泡性淋巴瘤中发现，高水平的bcl-2蛋白有抑制细胞死亡、延长细胞寿命、抗凋亡的作用，是细胞凋亡调控机制中的另一个关键蛋白[8]。有研究表明，bcl-2下调使刺激细胞凋亡的因子启动,诱导癌细胞凋亡以一种机体内普遍存在的“反馈”调节模式,维持肿瘤细胞数量的增加。但是,bcl-2对细胞的增殖并无作用,需要在其他多种因素和一些癌基因(如c-myc、p53)等协同作用下,使肿瘤细胞在增殖和凋亡之间失衡,最终导致细胞的恶性转化。本研究检测bcl-2蛋白表达结果显示其在乳腺腺病、乳腺纤维腺瘤、乳腺癌中的蛋白表达阳性率依次降低，组间比较差异具有统计学意义，提示其在乳腺癌中蛋白表达明显上调，与乳腺癌的发生具有一定联系。乳腺癌中bcl-2蛋白表达与临床分期呈显著性负相关，bcl-2蛋白表达阳性率越低，乳腺癌临床分期有显著性增高的趋势，对乳腺癌的进展与预后判断有一定影响，此结果与一些文献报道一致[10,11,12]。

　　关于caspase3与bcl-2之间如何相互作用的详细变化过程已成为目前凋亡信号传导途径研究中的主要热点问题之一。本实验中乳腺癌bcl-2蛋白表达与caspase3蛋白表达呈显著正相关,乳腺癌bcl-2和caspase3蛋白表达同时阳性的比率越高，临床分期越低，两个因子协同作用与临床分期的关系比其中任一单因子与临床分期的关系更密切,提示在乳腺癌的发生发展中二者存在一定的关系。国外文献报道[3],bcl-2是通过干扰细胞色素C的释放而阻断上游caspase蛋白酶的激活,抑制细胞的凋亡。近年来研究表明[7],bcl-2不仅可能通过抑制细胞色素C等从线粒体的释放调控着线粒体渗透性转换孔的开启,从而抑制caspase3的活化,还可能参与抑制caspase3的合成;另一方面, bcl-2不仅作用于caspase3的上游,它还是caspase3的直接底物被caspase3特异性酶解的bcl-2片段从功能上发生了根本转换,从抑制凋亡变为触发凋亡[7]。总之，caspase3、bcl-2蛋白检测可作为乳腺癌临床评价肿瘤生物学行为及判断预后的重要参考指标。

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